楔入楔形:使用PIV5病毒制造针对MERS-CoV以及可能针对SARS-CoV-2的疫苗



在目前的情况下,科学界将所有力量集中在寻找和开发与传播病毒作斗争的方法和工具上就不足为奇了。今天,我们来看一项研究,来自美国微生物学会(ASM)的科学家描述了一种针对MERS病毒的非常有效的疫苗,该疫苗于2012年开始传播。根据科学家的说法,他们的发展可以帮助制造出针对目前肆虐的SARS-CoV-2的疫苗。所产生的疫苗的特殊性是什么?从何而来?如何有效地执行其任务?我们从科学家的报告中了解到这一点。走。

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大流行的COVID-19是由SARS-CoV-2冠状病毒(2019-nCoV)引起的潜在的严重急性呼吸道感染,已在全球正式宣布。关于Habré的许多信息都涉及此主题-始终记住,它既可靠又有用,反之亦然。

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MERS或中东呼吸系统综合症是呼吸器官的炎性疾病,其发展是由于感染了现在熟悉的Coronavirinae亚科的Betacoronavirus病毒。


MERS-CoV快照(黄色)。

MERS-CoV病毒的来源再次是蝙蝠。最早的人间感染病例是在2012年在阿拉伯半岛领土上记录的,但到2015年,该病毒已传播到东亚和欧洲国家。根据最新数据,确诊的MERS-CoV感染病例为2494人,其中858人死亡(数据来自02.02.2020)。数据因来源而异,但可以清楚地看到,MERS-CoV中的分布程度不如SARS-CoV-2中的分布程度大。尽管如此,中东病毒的死亡率也很高-约为35%。这个指标最令人担忧。

MERS-CoV是一种正链RNA病毒*,其中由于S蛋白而进入靶细胞病毒包膜*
阳性链RNA病毒* -阳性病毒RNA。这意味着可以将特定的病毒RNA序列直接翻译成病毒蛋白(例如,病毒复制所必需的蛋白)。因此,在具有正链的RNA病毒中,病毒RNA基因可以被视为病毒mRNA(信使RNA),并且可以被宿主细胞立即翻译。
病毒包膜* -覆盖许多病毒的外部包膜(衣壳)的附加包膜。
S蛋白由负责与病毒受体结合的S1亚基,通过受体结合域(来自受体结合域的 RBD)的二肽基肽酶4(DPP4或CD26)以及提供膜融合的S2亚基组成。

研究人员回忆说,目前还没有针对MERS-CoV的疫苗,只有一些进展令人怀疑。科学家认为,他们的工作将改变这种状况。

在这项研究中,科学家决定将注意力转向另一种病毒-PIV5。 PIV或副流感病毒(PG)有五个变种,其中三个引起人类疾病(从PG-1至PG-3),另外两个对人类无害(PG-4和PG-5)。


副流感病毒的TEM快照。

PG-5是副粘病毒科的风疹病毒属成员,其中包括腮腺炎病毒(MuV或“腮腺炎”)和2型人类副流感病毒(PG-2)和4型人类副流感病毒(PG-4)。PG-5编码八种已知的病毒蛋白。核衣壳蛋白(NP),磷蛋白(P)和RNA聚合酶蛋白(L)对于病毒RNA基因组的转录复制非常重要
转录* -以DNA为模板的RNA合成过程;将遗传信息从DNA转移到RNA。
复制*是基于亲本DNA创建两个子DNA分子的过程。
科学家认为,PG-5是未来疫苗的病毒载体*的极佳候选者尽管PG-5具有高度的传染性,但它还是非常安全的,它在制作有效疫苗时可以发挥作用。
病毒载体*是将遗传物质输送到靶细胞的工具。
另外,PG-5在其生命周期中没有DNA相,这避免了由于重组或插入而可能对宿主细胞DNA进行无意的遗传修饰。而且,与具有正链的RNA病毒相比,PG-5的结构非常稳定。当将F基因维持超过10代时,所产生的表达呼吸道合胞病毒的F基因的重组PG-5证实了这一点。

PG-5的另一个优势是它的成本效益,因为这种病毒可以长到8x10 8 PFU / ml(PFU-噬菌斑形成单位)。

以前,PG-5在与抗呼吸道合胞病毒和狂犬病的疫苗配合使用时已被用作病毒载体。在小鼠的实验过程中,发现表达流感病毒的NA(神经氨酸酶,是膜的一部分)的PG-5载体导致对实验对象的完全免疫。感染后4天,没有一例死亡甚至感染病例。但是,表达NP(核蛋白)的PG-5可以保护100%的实验小鼠免受H1N1流感病毒的致命毒株的侵害。

基于先前研究的积极结果,科学家决定将PG-5用作表达MERS病毒S蛋白的病毒载体。如前所述,所有实验均在小鼠上进行。

研究成果


研究人员初步将甲型流感病毒的HA(血凝素)基因引入PG-5基因组的不同位置,发现SH(小疏水性)和HN(血凝素-神经氨酸酶)中的插入片段具有更好的免疫反应。
流感病毒血凝素和神经氨酸酶*病毒的表面抗原,具有附着于靶细胞的能力。
鉴于此,决定在SH和HN的交界处引入MERS病毒的完整S基因。使用标准分子克隆方法(1A构建了一个含有全长cDNA * PG-5 的质粒*该质粒在SH和HN的连接处插入了S基因图片编号1


质粒*是与染色体分离的小DNA分子,能够独立复制。
cDNA * -互补DNA,即 在逆转录酶催化的反应中,在成熟mRNA(信使RNA)的基质上合成的DNA。
将该质粒与表达PG-5病毒(PIV5)的TG,NP,P和L RNA聚合酶的质粒一起转染BHK *细胞。
转染* -通过非病毒方法将核酸引入细胞。
BHK细胞*仓鼠肾)是仓鼠肾脏的结缔组织细胞(成纤维细胞),对许多影响人类的病毒敏感。BHK细胞用于转化以及稳定和瞬时转染。
结果是感染性病毒PIV5-MERS-S,将其进一步纯化并在MDBK细胞中大量繁殖*进行进一步分析。
MDBK细胞*Madin-Darby犬肾细胞)-狗肾细胞,由科学家SH Madin和NB Darby于1958年首次分离。这些细胞被用作模型哺乳动物细胞进行研究。
对病毒基因组进行了测序,并确认其包含所需的输入DNA序列。接下来,有必要检查感染了PIV5-MERS-S的细胞中S蛋白的表达。为此,将细胞以不同的MOI *值感染,然后将其溶解(溶解)以使用抗S抗体进行免疫印迹
MOI *感染复数)-感染复数,即 媒介(病毒)与感染目标(细胞)的比率。
免疫印迹*是基于电泳和酶免疫测定或放射免疫分析相结合的蛋白质检测的高度灵敏方法。
分析表明存在完整的S蛋白和S2片段,这表明其实施成功(1B)。通过免疫荧光分析(1C进一步证实了PIV5-MERS-S感染的细胞中S蛋白表达

科学家注意到,PIV5-MERS-S导致Vero *细胞大量合胞体形成此外,PIV5-MERS-S和常规PG-5(PIV5)的生长动力学非常相似(1D)。
合胞体*是一种组织类型,其中细胞没有完全分离,即 细胞质的某些部分被胞质间质网(胞质桥)相互连接。
Vero* — , .


2号图像

免疫PIV5-MERS-S产生中和抗体和T细胞介导的免疫。为了确定PIV5-MERS-S是否可以产生免疫反应,通过鼻内途径以每人10 4 PFU或10 6 PFU 的单剂量PIV5-MERS-S或对照PIV5-GFP病毒对小鼠进行免疫

尽管两种剂量均引起抗体应答,但中和效价分别为10 4和10 6剂量(2A2B在1:64和1:128时适度

科学家回忆说,免疫后物种C57BL / 6和BALB / c的小鼠分别产生以Th1和Th2为主的免疫反应。
Th(T-helpers)-增强适应性免疫反应(获得性免疫)的T淋巴细胞。

Th1-通过激活巨噬细胞促进细胞免疫应答的发展。

Th2-激活B淋巴细胞,这有助于体液免疫反应的发展。
一剂PIV5-MERS-S(10 6 PFU)在BALB / c(2C小鼠中产生的中和抗体效价最高为1:2000 ,这与该物种小鼠的Th2显性反应一致。

为了评估通过用PIV5-MERS-S免疫产生CD8 * T细胞的初级应答,将hDPP4-KI小鼠鼻内用PIV5-MERS-S(10 4 PFU)免疫
CD8* ( 8) — , - .
四周后,采取围栏检查是否存在MERS-CoV特异性肺驻留CD8 T细胞(3A)。


3号图片

3B - 3D所示,与PIV5-GFP感染的小鼠相比,PIV5-MERS免疫的小鼠肺中CD8-IFN细胞的百分比和总数显着增加。

为了评估MERS-S特异性CD8 T细胞的反应,进行了另一次MERS-CoV MA注射(10 4 PFU)。结果,与感染对照PIV5-GFP(3E - 3G的小鼠)相比,第四天CD8 T细胞的反应显着增加

与CD8 T细胞的初次应答(3B - 3G相比,还发现MERS-S特异性CD8 T细胞增加了10倍


第4号图片

由于进行PIV5-MERS-S免疫,可预防小鼠感染的死亡。为了确定PIV5-MERS-S在预防或修饰MERS-CoV病毒中的效力,通过鼻内途径用PIV5-MERS-S(10 4 PFU)免疫hDPP4 KI小鼠

免疫4周后,将小鼠用修饰为在小鼠中更具活性的MERS-S感染(4A)。用PIV5-MERS-S免疫的所有小鼠均在这种致命的感染中幸存下来,体重略有减轻(4B4C)。相反,所有感染了对照PIV5-GFP或PBS的小鼠都在感染后死亡。这表明PIV5-MERS-S可以完全保护小鼠免受致命感染。

尽管PIV5-MERS-S免疫小鼠的肺部清除率更高,但该方法无法提供完全的灭菌免疫力(4D)。


图5

感染后肺部的组织病理学研究表明,用PIV5-MERS-S免疫的小鼠的细胞碎片*明显少,单核浸润更多(5A5B)。
细胞碎片*是被质膜吞噬的剩余细胞,质膜被巨噬细胞吞噬。
还检测到强烈的白细胞浸润(主要是单核细胞)和较少的损害(水肿,透明膜,坏死细胞碎片等)。

在研究的最后阶段,科学家评估了PIV5-MERS-S或灭活的MERS-CoV诱导的保护性反应。为此,一些小鼠用PIV5-MERS-S(10 4 PFU)或PBS免疫,而另一些小鼠则用UV灭活的MERS-CoV免疫。

尽管PIV5-MERS-S提供了100%的致死性保护,但灭活的MERS-CoV仅保护了25%的小鼠(下图)。


第6张图片

接下来,对小鼠进行了研究,这些小鼠先被免疫,然后被MERS-CoV感染(下图)。


图片编号7

灭活的MERS-CoV免疫的小鼠的肺中观察到的嗜酸性粒细胞(一种白细胞)比感染MERSCoV的PBS或PIV5-MERS-S免疫的小鼠多。

与PBS相比,灭活的MERS-CoV组的血管周嗜酸性细胞浸润明显增加,但与PIV5-MERS-S免疫组相比,未观察到统计学差异。

还评估了肺泡中透明膜的形成,这是严重的肺部疾病的明显迹象。与PBS组相比,用PIV5-MERS-S免疫的小鼠对透明膜的形成具有明显的保护作用。但是用灭活的MERS-CoV免疫的小鼠的透明膜形成仅略有减少,这表明与PIV5-MERS-S相比,该免疫方法的效率较低。

要更详尽地了解这项研究的细微差别,建议您查看科学家报告

结语


在这项工作中,科学家们证明了一种非常成功的MERS-CoV病毒免疫小鼠的方法,该病毒自2012年以来一直在我们的星球上自由行走。

所开发方法的主要区别特征是使用另一种病毒即PG-5作为病毒载体。换句话说,楔块被楔块击落。

可以将病毒用作运送免疫所需基因的载体,这被认为是一种非常不寻常的方法,但是它可以有助于更有效地对抗病毒。研究人员自己说,他们的工作不仅旨在对抗MERS-CoV,而且还针对SARS-CoV-2(COVID-19)。两种病毒属于同一亚科,具有相似的感染途径和对靶细胞的作用。如果进一步开发出了先进的免疫方法,则有可能产生足够有效的疫苗。

这就是这项工作的作者计划在将来做的事情。他们是否成功制作出超级疫苗,时间会证明一切。但是,现在至少值得一提的是,他们对病毒的关注使所有人似乎都忘记了。

尽管如此,我们只能希望科学和所有参与其中的人,像以前一样,能够克服所有偏见和恐惧,克服所有障碍,并表明基于知识和逻辑的分析性思维始终能够不管乍一看多么可怕,都能找到摆脱当前状况的出路。

谢谢大家的关注,保持好奇心,祝您工作愉快。

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