👇🏼 👨‍🔬 🧝🏼 ChIP-seq数据分析：从组蛋白到计算机任务 ⬇️ 🍌 🚹

每年，圣彼得堡和莫斯科的生物信息学研究所都会招募生物学家，数学家和程序员，使他们沉浸在生物信息学的世界中。生物学家学习编程和培训以实现代码中的思想，计算机科学家学习生物学并将算法方法应用于生物学和医学问题。培训中最重要的部分是真实的科学项目。在本文中，我们将讨论在2019年JetBrains Research的Oleg Shpynov的指导下完成的研究所学生的工作和成果。该项目致力于使用机器学习研究人类染色质的变化。

信息科学系学生2019年生物信息学研究所

什么是测序，为什么需要

满足好奇心和自我了解的愿望从对人体解剖学的描述开始，逐渐加深并发展到更详细的水平。研究了血细胞及其与寄生虫的相互作用，遗传信息的传递机制以及癌细胞转移的形成。

测序技术的出现使我们更深入，可以直接面对遗传信息载体-DNA。换句话说，位于人体几乎每个细胞核中的脱氧核糖核酸负责我们的容貌，身高，发声的音质以及我们是否会得疟疾。但是，技术像生化方法一样，并没有停滞不前。它们的结合使“揭示”身体的更复杂机制成为可能。让我们更详细地处理这个问题。

我们如何排序生物

测序技术已经发生了变化，现在，随着技术的进步，根据意愿，可以对单个细胞进行测序，观察它们随时间的变化，或者只是获得有关遗传信息载体-DNA序列的完整信息。实际上，测序使您可以将生物分子翻译成文本文件，然后可以将其作为纯文本使用。现代测序方法使用“ shot弹枪”方法，并产生大量的短片段。在某些分析中，这些短片段被“试戴”在现有基因组上，并观察“文本”序列的差异。

什么是组蛋白及其影响

DNA链非常长，不能永久处于未扭曲状态-不方便且危险（在某处存在缝隙的可能性更大）。因此，分子呈螺旋状（非常强烈地扭曲）并紧密堆积，将自身包裹在特殊的蛋白质复合物上，例如卷发器上的头发。这些蛋白质称为核小体，由组蛋白构成。组蛋白修饰是表观遗传调控的更一般机制的一个例子。生物体还活着，需要对周围的变化做出反应。身体的反应包括基因表达的变化。如果基因所在的DNA片段紧紧包裹并缠绕在核小体上，则不可能到达该基因并阅读信息。因此，特殊的磷酸基和乙酰基被挂在组蛋白上，发生所谓的磷酸化或乙酰化。这导致组蛋白“移动”并获得所需的DNA片段。但是，核小体仍与DNA结合，可用于监管研究。

组蛋白乙酰化和甲基化的机理（来源）

染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）及其用途

要研究仍与蛋白质结合的DNA片段，有一种特殊的方法：染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）。该分析如下进行：

DNA及其相互作用蛋白之间的可逆交联（通常通过甲醛处理）
通过超声或核酸内切酶进行DNA分离和片段化
蛋白特异性抗体沉积
破坏蛋白质与DNA之间的交联，纯化DNA

简而言之，我们从溶液中去除与DNA连接的蛋白质，并使其“释放” DNA。从生物学的角度来看，作用的领域是可以理解的：对基因表达，封闭和开放区域等的研究。我们将在下面讨论程序员在此任务中可以做的事情。

在ChIP测序（-seq）的情况下，将扩增所得的DNA片段（片段的人工复制）并进行测序。 DNA小片段的序列集并研究生物信息学。

接收到的数据经过质量控制，经过过滤，与DNA序列比对并通过特殊程序进行处理。

DNA制备方案进行分析

查找DNA结合位点的任务通常称为峰调用任务，而工具类别是峰调用者。目前，有许多用于分析此类数据的计算方法和工具，但是，这些算法并不理想，并且存在许多局限性。对于该领域的程序员和计算机科学家而言，仍然存在许多未解决的计算问题。

以下是数学和技术专业学生正在解决的一些问题：

不均匀的碎片和控制

片段化过程中染色质的可用性在基因组的不同部分是不同的：在活跃转录的区域中更容易获得，因此，相应的DNA片段将在样品中占主导地位，这可能导致假阳性结果。相反，紧密堆积的区域可能不太可能碎裂，因此在样品中的表示较少，这可能导致假阴性结果。

单元数

经典技术具有许多局限性。因此，ChIP-seq通常需要大量细胞（约一千万个），这使得该方法在小型生物（例如真菌或原生动物）上的应用变得复杂，并且还限制了可以对有价值的样品进行的实验数量。

资料杂讯

在ChIP-seq实验过程中，不仅可以在最终文库中获得与蛋白质相关的DNA片段，而且还可以获得其他非特异性相关的片段。这可能是由于抗体的理想特异性不理想，洗涤游离DNA片段的问题等引起的。这样的碎片在数据中形成所谓的噪声。问题不仅在于噪声的存在，还在于其测量的复杂性。为了评估其水平，有一个信噪比（SNR）度量标准，该度量标准由每个样本获得的峰的数量和功率确定。但是，高SNR不能保证正确确定结合位点，而只能反映大量基因组区域的存在，它们被比对（在该位置的染色体上序列与所需序列重合）许多读段-DNA小片段。

解决问题的选项

作为学期研究项目的一部分，由JetBrains Research的Oleg Shpynov指导的生物信息学研究所的学生解决了部分任务。
嘈杂的高峰通话。
学生：Chaplygina Daria

在文章“ ChIP-seq实验中测序深度的影响”（1）中，作者研究了文库大小（初始读取数）对峰搜索算法结果的影响。他们通过从真实实验中随机取样，为不同类型的组蛋白修饰创建了人工数据集。不出所料，库越差，算法查找峰越困难，不同方法之间的结果不一致。但是他们也注意到，在使用相同工具的情况下，生物学复制品之间的协调性丧失了。在一个学期的项目中，我们调查了源数据中噪声的影响。

具有可控噪声水平的数据集是根据来自ENCODE项目站点的ChIP-seq实验的公开数据获得的ENCODE项目。为此使用了两种噪声模型：

附加模型。来自DNA随机部分的片段被添加到带有“干净数据”的源文件中。随机片段的比例为0％至90％。
概率模型。对于每个实验，都使用Tulip工具建立了数学模型。在它的帮助下，产生了一个全新的实验，其中一个参数-位于DNA-蛋白质结合位点内部的片段的百分比-从10％到0.5％不等。

概率模型。对于每个实验，都使用Tulip工具建立了数学模型。在它的帮助下，产生了一个全新的实验，其中一个参数-位于DNA-蛋白质结合位点内部的片段的百分比-从10％到0.5％不等。

应用概率噪声模型时数据变化的可视化

在获得的数据集上，我们分析了三种算法：MACS2（2），SICER（3）和SPAN（由JetBrains Research开发的算法，基于半监督）机器学习方法）。事实证明，使用固定的SNR，可以预测算法将发现的一组峰的预期准确性和完整性。在高噪声水平（或低SNR）下：MACS2和SICER几乎找不到峰值，而SPAN在指标组合方面显示出最稳定的结果。

受控噪声水平下峰值搜索算法的准确性和完整性

我们研究了在噪声过程中数据质量变化的两个指标：信噪比（SNR）和峰内碎片的百分比（FRIP-峰中读数的分数）。测量结果表明，对于相同的SNR，DNA –蛋白相互作用的每个区域中的片段比例可能会有很大差异（在某些情况下，差异高达50％）。评估这些ChIP-seq实验质量的现有标准和建议尚不完善，因此需要新的集成方法。
作为工作的一部分，我们还开发了用于半自动进行此类实验的管道。

：的方法和源代码实现

github.com/DaryaChaplygina/NoisyPeakCalling，

github.com/DaryaChaplygina/NoisyPeakCalling2。

深度学习救助！
学生：Daria Balashova

经典ChIP-seq方法的局限之一是大量必需的细胞物质，例如在稀少细胞群或对一个生物样品进行多次测量的情况下，该实验无法进行。新的ChIP-seq（4）超低输入（ULI）方法所需的材料明显更少-100,000个单元就足够了-但数据中的可变性和噪声水平更高。

深度机器学习方法的使用在生物信息学中正变得越来越流行，在解决诸如处理生物医学图像等问题方面显示出优异的成果。在“用卷积神经网络对全基因组组蛋白ChIP-seq进行去噪”一文中，作者提出了一种算法Coda是一种基于卷积神经网络提高ChIP-seq数据质量的方法。他们创建并训练了一个深度神经网络，不仅可以改善质量较差的数据，还可以在其中找到峰值。

在该项目的框架中，原始算法适用于ULI ChIP-seq数据。利用前一个项目的发现以及“衰老的人类单核细胞的表观遗传学变化”一文（6）中的ULI ChIP-seq数据，我们分析了算法的重要特征，例如改善了质量指标，例如SNR。结果，创建了DCNN算法。 -卷积神经网络，在生物重复的情况下，基于信噪比自动提高数据质量。如果改进和信号纯化效果很好，那么使用深度学习方法寻找蛋白质与DNA的结合位点仍然是一个未解决的问题，因为现有方法需要大量高质量的训练样本。

卷积神经网络DCNN应用的示意图表示方法的

实现和源代码：github.com/dashabalashova/Denoising_CNN。

而不是后记

生物信息学使您可以将程序员的方法应用于生物数据并获得新知识，这将有助于生物学家和医生研究人类。现在开放接受夏季学校2020的申请，该学校将于7月27日至8月1日在圣彼得堡举行。它是探索生物信息学的理想选择。

对于那些决定接受更严肃的培训的人-可以跳到最后一辆汽车，并在圣彼得堡和莫斯科申请生物信息学再培训计划，直到2月22日或3月1日在系统生物学务虚会上。

对于那些喜欢阅读和发现新事物的人，我们提供了一系列有关算法，编程，遗传学和生物学的书籍和教科书。

参考书目：

Jung, Y. L., Luquette, L. J., Ho, J. W., Ferrari, F., Tolstorukov, M., Minoda, A.,… & Park, P. J. (2014). Impact of sequencing depth in ChIP-seq experiments. Nucleic acids research, 42(9), e74-e74.
Zhang, Y., Liu, T., Meyer, C. A., Eeckhoute, J., Johnson, D. S., Bernstein, B. E.,… & Liu, X. S. (2008). Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome biology, 9(9), R137.
Xu, S., Grullon, S., Ge, K., & Peng, W. (2014). Spatial clustering for identification of ChIP-enriched regions (SICER) to map regions of histone methylation patterns in embryonic stem cells. In Stem Cell Transcriptional Networks (pp. 97-111). Humana Press, New York, NY.
Brind'Amour，J.，Liu，S.，Hudson，M.，Chen，C.，Karimi，MM，＆Lorincz，MC（2015）。一种超低输入的本地ChIP-seq协议，用于稀有细胞群体的全基因组分布分析。自然通讯，6（1），1-8。
Koh PW，Pierson，E.和Kundaje，A.（2017年）。使用卷积神经网络对全基因组组蛋白ChIP-seq进行消噪。生物信息学，33（14），i225-i233。
Schukina，Bagaitkar，Shpynov等人，综述，artyomovlab.wustl.edu / aging

文章作者：
Olga Bondareva，生物信息学研究所
Oleg Shpinov，JetBrains研究
Ekaterina Vyakhhi，生物信息学研究所

ChIP-seq数据分析：从组蛋白到计算机任务