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“看，这是什么”：人工DNA的自我复制



任何生物体的主要区别特征之一就是能够保存和复制必要的信息以创建自己的种类的能力。当一对子代从相同的父代DNA出现时，这主要表现在DNA复制中，它们是其祖先的精确副本。在自然界中，这个过程无处不在，但是在实验室条件下从头开始重新创建它是极其困难的，但是，这是非常现实的。

生物化学研究所的科学家。马克斯·普朗克（德国）成功创建了一个能够复制自己的DNA的生物系统。使用了哪些技术来创建合成复制DNA，所得系统的有效性如何，这一发现对现代合成生物学意味着什么？我们将在科学家的报告中找到这些问题的答案。走。

学习基础


在创建人造生物系统的领域中，复制的能力是所创建系统实用性的关键方面。根据科学家的说法，这可以通过实现以下基本组件来实现：复制*，转录*和DNA 翻译*。
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换句话说，为了创造出完整的人造生命，有必要实现自我编码的再现，即自我复制。这是一个极其复杂和混乱的过程。

该研究的作者指出，在基于现有生物化学的系统中，例如MPC（基于最小蛋白质的细胞），考虑到完全无细胞的环境，自我复制需要彻底重新思考分子生物学，包括DNA的复制，转录和翻译。

从DNA合成蛋白质可以在某些基于噬菌体* RNA聚合酶的重组系统中实现-大肠杆菌翻译机制的主要部分和最低限度的能量再生系统，即PURE- 使用重组元素合成蛋白质 （使用重组元件合成蛋白质）。
噬菌体或噬菌体*是选择性感染细菌和古细菌细胞的病毒。在生物学中，它被用作载体（将遗传物质转移到细胞中的DNA）。
同时，基于转录和翻译（TTcDR- 转录-翻译偶联的DNA复制）来重现基因组DNA复制的过程仍然非常困难，该过程使用自编码复制子*编码PURE系统的所有大分子成分。
复制瘤*是一种复制细菌DNA的多蛋白复合物。
基于来自噬菌体（例如Phi29）的DNA聚合酶（DNAP）的DNA复制可以帮助实现TTcDR技术。

但是，在TTcDR方法中，只有通过阻止某些复制因子才能实现完整的Phi29基因组。

以上所有方法都有其理论上的优势，但在实践中并未给出完整的结果。在我们今天正在考虑的工作中，科学家描述了一个翻译系统，该系统可在定义明确的无细胞条件下提供自我编码的复制和大型DNA基因组的表达。特别地，实现了超过116kb的基因组的自我复制。 （数千个核苷酸），涵盖了所有翻译因子大肠杆菌（大肠杆菌），所有三种核糖体RNA，能量再生系统以及RNA和DNA 聚合酶*。
聚合酶*是一种执行核酸聚合物合成的酶。DNA聚合酶合成DNA，而RNA聚合酶合成RNA。该过程通过亲本DNA或RNA的互补复制进行。
此外，创建的系统展示了能够合成30多种翻译因子的能力，其中一半的表达量等于或大于入门级的表达量。

研究成果


在第一阶段，科学家使用PURExpress系统的标准协议测试了自编码的Phi29-DNAP依赖性TTcDR 。

首先将侧接* T7 启动子的Phi29-DNAP编码区克隆到pCR-Blunt TOPO载体（pREP，1a）中。
启动子*是RNA聚合酶用作转录起始区域的DNA核苷酸序列。


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从理论上讲，这种体系结构应该使用自编码的DNAP 作为滚动环提供自发的RNA 复制，而无需其他复制蛋白或外部提供的DNA引物。
滚动环型复制*是一种单向核酸复制过程，在此过程中会快速合成多个副本的环DNA或RNA分子。
但是，使用标准的PURExpress反应与dNTP（含有C 5 H 10 O 4脱氧核糖的核苷酸）和4 nM pREP（补充了Zeocin C 55 H 86 N 20 O 21 S 2的 LB培养基）进行反应时，未检测到DNA合成。琼脂糖凝胶电泳*，也不能通过实时聚合酶链反应*（1b和1c）进行。
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为了在不使用专门的PURE系统的情况下改善DNA复制，决定优化标准PURExpress反应方案。为此，增加了翻译因子，核糖体和还原剂的相对数量，同时降低了tRNA（转运RNA）和rNTP（核糖核苷三磷酸）的水平（1d）。

使用这种优化的PURE组成（PURErep），可以在TTcDR反应（1b和1e）中实现pREP单体单元的约5-12倍复制。通过复制产物的Mlu消化*（1c）证实了全尺寸的pREP合成。
MluI *是可商购的限制性核酸内切酶，即MluI *。催化核酸水解的酶。
绿色荧光蛋白（sfGFP）的表达用作翻译活性的评估因子。发现与不具有TTcDR的PURE相比，PURE的组成变化导致蛋白质合成降低20-40％。但是，鉴于PURErep系统与DNA复制的相容性得到改善，蛋白质表达的这种下降仍然可以接受。

基于qPCR的DNA复制分析表明，对于各种初始基质浓度，DNA的复制时间稳定（1-2小时），而在30°C（1e）下24小时后，DNA复制仍继续。

当仅将完成的PURErep / pREP反应产物的4％直接转移到新的PURErep混合物中时，TTcDR在超过五代的连续稀释中也是稳定的（1f）该观察结果的主要结论是，TTcDR产物可作为DNA自我复制的模板，可用于多代人。

科学家注意到，大量的低电泳迁移率的产物通常会作为滚环复制，这是在实验过程中观察到的。这些反应产物可以由高分子量串联体*和/或DNA / MgPPi簇表示。
Concatemer * -连续序列簇中组装的DNA序列的多个副本。
还检测到了大小约为5 kb的产物的形成。在未经处理的样品中。因此，TTcDR反应可产生大量的pREP单体拷贝。

此外，科学家在去除母体血浆后能够转化大肠杆菌产品。所得纯化的反应产物的尺寸与单体pREP相同。

在下一阶段，科学家决定创建一组编码PURE反应重要成分的基因：31，这是大肠杆菌的必需翻译因子（FT）。

为此，结合三个大质粒分别研究了来自pREP（4.6 kb）的TTcDR *：pLD1（30 bp，13 FT），pLD2（20 bp，8 FT）和pLD3（23 bp，9 FT）。所有这些克隆，以提供的31个翻译因子的30重组表达的大肠杆菌细菌。
质粒*是能够独立复制的小DNA分子。
所有四个质粒（包括pREP）的TTcDR产物均显示出相同的MluI限制性酶切特征：克隆质粒，通常在大肠杆菌中繁殖（2a）。


2号图像

还值得注意的是，pLD TTcDR产品可以直接转化为大肠杆菌，并以单体质粒的形式存储在大肠杆菌中。

修饰后的PURErep混合物还可以在反应过程中在通用培养基（2b）中将所有三个pLD质粒与PURErep一起完全复制。

科学家们并没有止步于此，在下一阶段的研究中，他们试图通过共同复制编码PURE系统其他成分的质粒：EF-Tu（pEFTu）和核糖体RNA 操纵子* rrnB（ prRNA是编码23S rRNA（核糖体RNA），16S rRNA，6S rRNA和tRNA（运输RNA，在这种情况下为Glu2）的前体rRNA）（2c）。
Operon *是单细胞基因组的功能单元，其中包括编码蛋白质的基因。
针对质粒特异性扩增子的 QPCR实验*证实，与原始数目（2c）相比，所有六个质粒的单体单元（总DNA长度为93 kb）复制了约2-8倍。
扩增子*是扩增的染色体外单位（DNA片段的复制）。
联合质粒复制成功的另一个证实是形成了对博来霉素（pREP）或卡那霉素（质粒pLD和prRNA）或羧苄青霉素（pEFTu）耐药的菌落。这些菌落是用DpnI（2d）处理的PURErep反应产物转化的结果。

选择的26个克隆菌落，然后进行限制性酶切分析，再次证实了所有六个质粒的TTcDR成功（2e）。

使用与前述相同的方法，科学家进行了另一种程序的五个附加质粒的联合复制：基于肌酸激酶（pCKM），腺苷酸激酶（pAK1）和核苷二磷酸激酶（pNDK）的三磷酸核苷最小再生系统的基因；以及T7 RNA聚合酶（T7RNAP）和焦磷酸酶（pIPP）。


第3张图片，

总大小为116.3 kb这套11个质粒的集合达到了估计的基因组长度的100％以上，该基因组长度建议用于最小的自我复制系统，该系统仅依赖于低分子量营养素（3a）。

然后，科学家决定检查PURErep是否可以在复制过程中提供平行的基因表达。为此，检查了在三种pLD质粒：pLD1，pLD2和pID3（不包括pEFTu）上编码的FT的多顺反子表达。

为了研究PURErep是否通常能够支持这些质粒的多顺反子表达，在存在BODIPY-Lys-tRNALys的情况下，从每个单独的质粒进行了无细胞表达，BODIPY-Lys-tRNALys提供了翻译产物的荧光标记。

为了提高检测灵敏度并定量新合成的蛋白质，使用稳定同位素标记的质谱法进一步对蛋白质表达进行了定量分析。


图片编号4

该分析为由pLD（4a）编码的蛋白质的所有FT亚基的合成提供了令人信服的证据。还观察到了在pLD2和pLD3中编码的蛋白质的部分或完全再生。

表达分析表明，即使在未修饰的PURErep与pREP结合使用时，pLD编码的32个FT子午线也可以完全复制，并且约一半编码的FT肽链表达，其数量相当于或超过起始肽链。

为了更详尽地了解这项研究的细微差别，我建议您研究一下科学家的报告和其他材料。

结语


在这项工作中，科学家设法实现了许多同事以前只能梦想的事情-创建了一个能够自我复制的人工系统。

夸张地说这意味着他们能够迈出创建一个能够自我复制的系统的第一步，从而尽可能地模拟生物过程。

该研究的作者对结果感到非常满意，并计划在将来用其他DNA片段扩展人工基因组。他们希望创建一个具有外壳的系统，该外壳可以通过吸收营养和处置废物来维持生存能力。这种人造结构可以用作天然物质的专门生产生物设备，也可以用作创建更复杂系统的基础。

克隆是一个复杂的过程，毫无疑问，但是创建一个完整的，可行的合成系统是一个完全不同的层次。有人会说这样的研究是危险的，因为没有人有权承担大自然的责任。但是，一个人的好奇心几乎是不可能平静下来的。我们理解一切并重复一切的愿望是科学进步的驱动因素之一。不管是好是坏，这是一个没有单一答案的问题。我们只能欣赏聪明的人的成就，并审慎地展望未来，同时希望有一个乌托邦。

谢谢大家的关注，保持好奇心，祝大家周末愉快！:)

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