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Sars milagroso? Genealogia do coronavírus Wuhan


Não, bem, o que é feito pelo homem? Que tipo de bobagem? Pensei quando ouvi pela primeira vez a hipótese de que o Kovid-19 era causado por vazamento de laboratório ou mesmo por um ataque biológico direcionado. E cada vez que ele simplesmente rejeitava essas especulações, quando elas mais uma vez nadavam em minha direção em um fluxo tempestuoso de infoshum de coronavírus. Bem, pense bem, existe um instituto de virologia em Wuhan, você nunca sabe.

Em algum momento, já era necessário descartá-lo razoavelmente, porque os partidários da loucura começaram a substanciar suas teses sobre a possível natureza artificial do vírus com argumentos da biologia molecular, e aqui eu já queria esmagar suas teorias da conspiração com fatos científicos frios. Bem, se não como autores de um artigo na Nature (me pareceu), pelo menos como Panchin respeitava por mim .

E aqui, em busca dos argumentos contra o vírus criado pelo homem, o vírus da dúvida me infectou. De fato, qual é o motivo da dúvida? O fato de que quanto mais você se aprofundar nas atividades dos coronavirusologistas nos últimos 15 a 20 anos, melhor entenderá que criar exatamente tais quimeras como a CoV2 era comum nelas. E CoV2 é uma quimera óbvia, baseada na cepa de morcego de RaTG13, na qual o local de ligação ao receptor (RBM) na proteína spike é substituído do morcego por pangolínio e, além disso, uma seção especial de 4 aminoácidos é inserida, o que cria um local de clivagem de furina, que, como os virologistas descobriram anteriormente que expande significativamente o "repertório" do vírus em termos de em quais células ele pode penetrar.Provavelmente, foi graças a este novo site furin que o novo mutante conseguiu pular das transportadoras originais para as pessoas.

Levando em consideração as alturas que a engenharia genética alcançou hoje, sintetizar CoV2 usando o método descrito acima não seria difícil, mesmo para um especialista iniciante. De fato, virologistas, incluindo Shi Zhengli , chefe do departamento de coronavírus do Instituto Wuhan de Virologia , têm se envolvido repetidamente nessas coisas - como substituir o RBM em um tipo de vírus pelo RBM de outro(aqui está o trabalho do grupo Shi Zhengli de 2007) e adicionando um novo local de furina que pode dar ao coronavírus específico de uma espécie animal a oportunidade de começar a usar o receptor ACE2 de outras espécies.

Minuto de Cuidados com OVNI


A pandemia de COVID-19, uma infecção respiratória aguda potencialmente grave causada pelo coronavírus SARS-CoV-2 (2019-nCoV), foi anunciada oficialmente no mundo. Há muitas informações sobre Habré sobre esse tópico - lembre-se sempre de que pode ser confiável / útil e vice-versa.

Pedimos que você seja crítico com qualquer informação publicada.


Fontes oficiais

, .

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Shi Zhengli em seu laboratório no Instituto Wuhan de Virologia

Mas antes de produzir conspiração aqui, vamos mergulhar no bio logia.

Biologia


Então, vamos começar do fogão. Que tipo de sítio de furina, que tipo de RBM, que tipo de proteína de espiga em geral? De fato, se você percorrer a selva da terminologia, tudo será conceitualmente simples. Por exemplo, uma proteína pontiaguda é exatamente o que sai de uma partícula de vírus (proteína S), para a qual esses vírus "coroavam":


É com a ajuda dessas proteínas que o virião se agarra ao receptor da célula vítima (ACE2 no nosso caso) e depois penetra no interior. Portanto, podemos dizer que esta é a parte mais importante do vírus, porque determina quais animais podem afetar e quais não são - os receptores ACE2 em diferentes espécies são ligeiramente diferentes estruturalmente. Ao mesmo tempo, de todo o enorme genoma de 30 kilobases pelos padrões virais, o gene dessa proteína é de apenas 12 a 13%, ou seja, cerca de 1300 aminoácidos. É assim que a proteína spike é estruturada no CoV2 e seus parentes próximos:


Como pode ser visto na figura acima, a proteína S consiste em duas subunidades: S1 e S2. É o S1 que interage com o receptor ACE2, e o local em que ele é chamado Domínio de Ligação ao Receptor (RBD), e a área de contato direto, o santo dos santos, é chamada Motivo de Ligação ao Receptor (RBM). Aqui está uma bela ilustração de uma obra igualmente bela :

RBD CoV2, ACE2.
() 2019-nCov. NTD, N- . RBD, - . RBM, - . SD1, 1. SD2, 2. FP, . HR1, 1. HR2, 2. TM, . IC, .
() RBD 2019-nCov. RBM .
() RBD 2019-nCov, ACE2. ACE2 . RBD 2019-nCoV , RBM — . RBD 2019-nCov . N- ACE2, , .
Overall structure of 2019-nCoV RBD bound with ACE2.
(a) Overall topology of 2019-nCoV spike monomer. NTD, N-terminal domain. RBD, receptor-binding domain. RBM, receptor-binding motif. SD1, subdomain 1. SD2, subdomain 2. FP, fusion peptide. HR1, heptad repeat 1. HR2, heptad repeat 2. TM, transmembrane region. IC, intracellular domain.
(b) Sequence and secondary structures of 2019-nCoV RBD. The RBM is colored red.
() Overall structure of 2019-nCoV RBD bound with ACE2. ACE2 is colored green. 2019-nCoV RBD core is colored cyan and RBM is colored red. Disulfide bonds in the 2019-nCoV RBD are shown as stick and indicated by yellow arrows. The N-terminal helix of ACE2 responsible for binding is labeled.

Então aqui. Quando o genoma da CoV2 foi decodificado apenas, a princípio não eram conhecidas cepas diretamente relacionadas a ele. Mas já em 23 de janeiro de 2020, Shi Zhengli lançou um trabalho em que anunciou que o CoV2 é 96% coincidente com a cepa RaTG13, que seu laboratório em 2013 isolou de morcegos de Yunnan. É verdade, fora de seu laboratório até janeiro de 2020, ninguém sabia sobre essa tensão.

Ficou imediatamente claro que RaTG13 é um garoto especial. Dê uma olhada no gráfico:


Este é um gráfico da similaridade de CoV2 com outras cepas conhecidas. Quanto maior a curva, maior a porcentagem de correspondência de nucleotídeos. Como você pode ver, na região do gene da proteína muito espetada (S), apenas o RaTG13 está mais ou menos próximo do CoV2, e todas as outras cepas deste local atingem o pico - ambas as cepas de vírus de outros morcegos e o primeiro SARS-CoV (curva vermelha). ) Mas até agora não há nada suspeito - existem cepas desconhecidas das cavernas de Yunnan que ainda abrigam cepas desconhecidas da ciência? Bem, sim, não está muito claro como exatamente o vírus chegou a Wuhan a partir daí, mas o que não acontece.

Pangolins


Então os pangolins apareceram em cena: em fevereiro, outro grupo de cientistas chineses descobriu em seus compartimentos uma cepa de coronavírus de pangolim, que, embora geralmente pior que o RaTG13, era semelhante ao CoV2 (90%), em que a proteína spike RBM era quase idêntica - era diferente somente para 1 aminoácido (veja as duas seqüências superiores, os pontos significam coincidência com a primeira sequência):


Além disso, no primeiro trimestre da proteína S, a cepa de pangolínio não é semelhante à CoV2, e a sequência após RBM nas três linhagens (CoV2, Pangolin, RaTG13) coincide mais ou menos. Mas o RBM do RaTG13 em si é muito diferente do CoV2, que pode ser visto no declive acentuado do gráfico verde do RaTG13 em comparação com o gráfico vermelho do CoV2 na região do RBM (barra vertical rosa) no gráfico a seguir:


Essa diferença também é confirmada pela análise filogenética dessas três áreas destacadas no gráfico acima - de acordo com a RBM, a cepa de pangolim está mais próxima do CoV2 do que o RaTG13, mas à esquerda e direita do RBM ao CoV2 está mais próxima do RaVG13. Ou seja, existe uma recombinação óbvia, como os próprios autores e algumas outras obras mencionam.

A propósito, de onde vieram os pangolins dos pesquisadores? E daqui:


Eles foram confiscados de contrabandistas pela alfândega chinesa e transferidos para um centro de reabilitação em Guangdong, onde morreram com graves sintomas de coronavírus. Obviamente, isso não poderia deixar de interessar os virologistas locais, que isolaram diferentes biomateriais deles:
, , - 2019 . (Manis pentadactyla) 25 (Manis javanica). ; , , . , , , , , , .
Pangolins used in the study were confiscated by Customs and Department of Forestry of Guangdong Province in March-December 2019. They include four Chinese pangolins (Manis pentadactyla) and 25 Malayan pangolins (Manis javanica). These animals were sent to the wildlife rescue center, and were mostly inactive and sobbing, and eventually died in custody despite exhausting rescue efforts. Tissue samples were taken from the lung, lymph nodes, liver, spleen, muscle, kidney, and other tissues from pangolins that had just died for histopathological and virological examinations.
A propósito, e não apenas local, porque outros pesquisadores chineses (Hong Kong neste caso) também receberam amostras de pangolinas confiscadas e, em fevereiro de 2020, também divulgaram um trabalho semelhante , observando sinais claros de recombinação na proteína de pico CoV2:
Recebemos amostras de tecidos congelados (pulmões, intestinos, sangue) que foram retirados de 18 pangolins malaios ( Manis javanica ) durante agosto de 2017 - janeiro de 2018. Esses pangolins foram obtidos durante as operações de combate ao contrabando pela alfândega de Guangxi. É surpreendente que o seqüenciamento de alto desempenho de seu RNA tenha revelado a presença de coronavírus em seis (dois pulmões, dois intestinos, uma mistura de pulmões e intestinos, um sangue) de 43 amostras.
...
, , , RaTG13 2019-CoV2 (. 1c, d). , 2019-CoV2 - (RBD; 97,4%; . 1c . 2a), 2019-CoV2 RaTG13. RaTG13 2019-CoV2 89,2% RBD. 2019-CoV2 RBD, RaTG13 2019-CoV2 ( 442, SARS-CoV ).
We received frozen tissue (lungs, intestine, blood) samples that were collected from 18 Malayan pangolins (Manis javanica) during August 2017-January 2018. These pangolins were obtained during the anti-smuggling operations by Guangxi Customs. Strikingly, high-throughput sequencing of their RNA revealed the presence of coronaviruses in six (two lung, two intestine, one lung-intestine mix, one blood) of 43 samples. With the sequence read data, and by filling gaps with amplicon sequencing, we were able to obtain six full or nearly full genome sequences — denoted GX/P1E, GX/P2V, GX/P3B, GX/P4L, GX/P5E and GX/P5L — that fall into the 2019-CoV2 lineage (within the genus Betacoronavirus) in a phylogenetic analysis (Figure 1a).
…
More notable, however, was the observation of putative recombination signals between the pangolins coronaviruses, bat coronaviruses RaTG13, and human 2019-CoV2 (Figure 1c, d). In particular, 2019-CoV2 exhibits very high sequence similarity to the Guangdong pangolin coronaviruses in the receptor-binding domain (RBD; 97.4% amino acid similarity; indicated by red arrow in Figure 1c and Figure 2a), even though it is most closely related to bat coronavirus RaTG13 in the remainder of the viral genome. Bat CoV RaTG and the human 2019-CoV2 have only 89.2% amino acid similarity in RBD. Indeed, the Guangdong pangolin coronaviruses and 2019-CoV2 possess identical amino acids at the five critical residues of the RBD, whereas RaTG13 only shares one amino acid with 2019-CoV2 (residue 442, human SARS-CoV numbering).
A propósito, os autores deste artigo também destacaram a mosaicidade filogenética explícita da proteína spike CoV2:
Curiosamente, a análise filogenética de apenas sites sinônimos na RBD mostrou que a posição filogenética da guangdong pangolin é consistente com a do restante do genoma viral, ou seja, não é o parente mais próximo de 2019-CoV2 (Figura 2b). Portanto, é possível que a semelhança de aminoácidos no RBD dos coronavírus de pangolim e 2019-CoV2 seja devida à evolução convergente mediada seletivamente, e não à recombinação, embora seja difícil escolher entre esses cenários com base nos dados disponíveis.
Texto original
Interestingly, a phylogenetic analysis of synonymous sites alone in the RBD revealed that the phylogenetic position of the Guangdong pangolin is consistent with that in the remainder of the viral genome, rather than being the closest relative of 2019-CoV2 (Figure 2b). Hence, it is possible that the amino acid similarity between the RBD of the Guangdong pangolin coronaviruses and 2019-CoV2 is due to selectively-mediated convergent evolution rather than recombination, although it is difficult to choose between these scenarios on current data.
Traduzido do científico, as palavras dos autores significam que, se analisarmos a RBD inteira das três linhagens, descartando as diferenças óbvias (substituições não-sinônimas) entre elas, que são principalmente atribuíveis à RB M (que, lembro-me, é idêntica entre CoV2 e Pangolin), e construímos árvore filogenética por substituições sinônimas, a CoV2 está mais próxima do RaTG13 e não da linhagem do pangolim. O que é bastante estranho à luz do fato de que o pangolini com CoV2 tem RBM idêntico (ou seja, um segmento dentro do RBD).

Os autores teorizam ainda que isso pode ser o resultado de uma evolução convergente, ou seja, que cepas de CoV2 e pangolins chegaram ao RBM idêntico, cada um à sua maneira, e não através da recombinação conjunta de ancestrais comuns. Porque era realmente muito estranho que a recombinação tivesse que acontecer - como se alguém apenas pegasse um pedaço de RBM de uma cepa de pangolim e o substituísse por RBM no RaTG13. E isso não é como a evolução, mas, perdoe Darwin, Design Inteligente.

Genealogia das pessoas coroadas


Para entender melhor a origem do CoV2, vamos dar uma olhada na sequência da proteína spike em nossa trindade: CoV2, RaTG13 e pangolin - compare a diferença entre pares (aminoácidos idênticos são marcados com pontos, letras vermelhas indicam a diferença e traços indicam aminoácidos excluídos / adicionados) :


Pode-se observar a olho nu que, no primeiro trimestre da sequência, a cepa de pangolínio está longe de CoV2 e RaTG13. Bem, o RaTG13, se não fosse o gráfico na região RBM (retângulo vermelho), seria tão próximo do CoV2. Mas, como eu já disse, o mesmo local no CoV2 é o mais próximo da cepa de pangolim.

A propósito, e quanto a outras cepas de pangolim? Vamos dar uma olhada. Afinal, até agora, apenas analisamos o vírus isolado de pangolins confiscados pela alfândega em 2019. E também houve um lote de pangolins confiscados em 2017, e eles também tiveram uma cepa semelhante isolada. Se compararmos o RaTG13 com os genomas de vírus dos pangolins de 2017 e 2019, tudo também é interessante aqui:


No primeiro trimestre da proteína S, as cepas de pangolim de 2017 estão mais próximas do RaTG13 (e CoV2) do que suas contrapartes de pangolim de 2019 (MP789). Ao mesmo tempo, todos os três têm um ancestral comum recente e claro nas áreas destacadas por retângulos verdes, e nessas áreas o RaTG13 e o pangolin-19 (MP789) estão mais próximos do que o pangolin-17, pois possui várias mutações comuns com o RaTG13 (circuladas em vermelho e elipses azuis), que não são observadas na legenda-17. Ao mesmo tempo, o RBM para todos os três é diferente e diferente aproximadamente na mesma proporção e em locais semelhantes.

Talvez, mesmo após a separação dos ancestrais do RaTG13 e MP789, o MP789 tenha substituído uma grande porção no primeiro trimestre da proteína S (que não ocorreu no RaTG13 e na pangolin-17), e o restante da proteína S permaneceu comum nos três. E então os caminhos dos pools genéticos RaTG13 e MP789 se reuniram novamente e em um acesso de paixão deu origem ao CoV2. Também é possível que o ancestral do RaTG13 seja o resultado da recombinação dos ancestrais das cepas de pangolim.

Também é interessante ver a mutação idêntica única (QTQTNS) em RaTG13 e pangolin-19, bem na frente do local onde o CoV2 possui um novo local de clivagem de furina, que surgiu devido à inserção de 4 novos aminoácidos nesse local (PRRA). Se você observar a sequência nucleotídica em torno dessa mesma mutação, poderá ver que RaTG13 e CoV2 estão mais próximos um do outro do que o pangolin-19, pois eles conseguiram acumular várias mutações comuns (destacadas em azul):


A propósito, com o Orf1ab, o CoV2 também tem um salto filogenético: 1a está mais próximo do RaTG13, mas 1b está mais próximo do pangolin-19:


Ou seja, acontece que o ancestral do CoV2 pecou com o ancestral comum do pangolin-19, pelo menos duas vezes? Pela primeira vez - quando ele (junto com um ancestral comum com o RaTG13) herdou o Orf1ab e a segunda parte da proteína tipo espiga com a mutação QTQTNS, e segundo - quando ele adquiriu 1b junto com o RBM, que já é diferente do RaTG13. Não, é claro, isso é possível e por si só não é particularmente digno de nota - afinal, esses vírus sofrem mutações e se recombinam constantemente. Outra questão é onde exatamente os morcegos e os vírus pangolins podem ser encontrados entre si para essas orgias - em cavernas nas montanhas, "mercados úmidos", abrigos para animais confiscados ou até em laboratórios. Mas vamos tirar um momento com essas perguntas. Primeiro, considere o aspecto mais atraente do novo vírus - uma barra lateral de 4 aminoácidos que o transformou em um super assassino.

Estou acertando, mas com força


É completamente impossível ignorar essa caixa PRRA entre S1 e S2. Como uma lasca, destaca-se no genoma do nosso novo CoV2. Esta caixa não é simples, mas dourada. Ela cria o local de clivagem furin , que mencionei no início. Que tipo de animal é esse? Vou tentar explicar brevemente. Lembre-se da estrutura da nossa proteína spike? Aqui está um diagrama visual:


A proteína consiste em duas partes, S1 e S2, das quais S1 é responsável pelo contato primário com o receptor (o mesmo Domínio de Ligação ao Receptor / Motivo), e S2 é responsável pela fusão com a membrana celular e penetração na célula. Ele inicia o processo de fusão marcado com um peptídeo de fusão amarelo, mas para iniciar seu negócio sujo, alguém deve cortar a proteína S em um dos locais destacados por losangos no diagrama acima. O vírus não possui seus próprios “cortadores” (existem outros, mas isso é irrelevante), então ele conta com várias proteases de suas vítimas, o benefício de tais proteases, como você pode entender pela abundância de cores desses mesmos losangos, existem vários tipos. Mas nem todas são iguais e nem todos os tipos de células possuem as proteases necessárias ao vírus. E o furin é apenas um dos mais eficazes, e até vive não apenas na superfície das células, mas também no interior. Mais claramente, o perigo do novo local de furina é demonstrado pela diferença entre CoV2 e seu SARS-CoV "precursor":


Como pode ser visto no diagrama, no caso da CoV2, graças ao local da furina, não são duas, mas três classes de proteases (três pacmen multicoloridos) que podem cortar sua proteína S fora da célula. Mas talvez a diferença mais importante seja que a furina também esteja presente dentro da célula, para que ela possa cortar a proteína S imediatamente após a montagem do virion, aumentando assim a capacidade de novos virions se fundirem com outras células - sem sair das bilheterias, por assim dizer.

A propósito, é provável que seja o novo local de furina que tenha um papel importante na morbimortalidade pronunciada e dependente da idade da CoV2:
, , , , , SARS-CoV-2. () COVID-19 . SARS-CoV-2 , .
Patients with hypertension, diabetes, coronary heart disease, cerebrovascular illness, chronic obstructive pulmonary disease, and kidney dysfunction have worse clinical outcomes when infected with SARS-CoV-2, for unknown reasons. The purpose of this review is to summarize the evidence for the existence of elevated plasmin(ogen) in COVID-19 patients with these comorbid conditions. Plasmin, and other proteases, may cleave a newly inserted furin site in the S protein of SARS-CoV-2, extracellularly, which increases its infectivity and virulence.
Ah, sim, ele corta proteínas da furina em locais estritamente definidos, ou seja, após a sequência RxxR (ou seja, Arg-XX-Arg, onde X pode ser qualquer aminoácido). Além disso, se a arginina também estiver em segundo ou terceiro lugar (ou seja, RRxR ou RxRR), a eficiência da clivagem desse local aumentará significativamente.

Portanto, o aparecimento de um novo local de clivagem furin por especialistas foi notado imediatamente . Ainda faria! Afinal, nenhum dos parentes mais próximos ou distantes do Cov2 possui esse site - aqueles coronavírus que o possuem são apenas 40% próximos do Cov2 em termos do genoma:
Verificou-se que todas as proteínas spike com uma homologia de proteína SARS-CoV-2 superior a 40% não tinham um local de clivagem de furina (Figura 1, Tabela 1), incluindo Bat-CoV RaTG13 e SARS-CoV (com uma identidade de sequência de 97,4 % e 78,6%, respectivamente). O local de furin RRAR no SARS-CoV-2 é único em sua família, graças ao inserto PRRA exclusivo. Este site em SARS-CoV-2 dificilmente poderia ter evoluído de MERS, HCoV-HKU1, etc. Das seqüências atualmente disponíveis nos bancos de dados, é difícil encontrar a fonte. Talvez haja muito mais seqüências intermediárias evolutivas aguardando descoberta.
Texto original
It was found that all Spike with a SARS-CoV-2 Spike sequence homology greater than 40% did not have a furin cleavage site (Figure 1, Table 1), including Bat-CoV RaTG13 and SARS-CoV (with sequence identity as 97.4% and 78.6%, respectively). The furin cleavage site “RRAR” in SARS-CoV-2 is unique in its family, rendering by its unique insert of “PRRA”. The furin cleavage site of SARS-CoV-2 is unlikely to have evolved from MERS, HCoV-HKU1, and so on. From the currently available sequences in databases, it is difficult for us to find the source. Perhaps there are still many evolutionary intermediate sequences waiting to be discovered.
Aqui está uma ilustração clara do mesmo artigo da citação acima (os coronavírus com um local de furina estão marcados em rosa, 3 cepas diferentes de Cov2 são mostradas às 10 horas):


O parente mais próximo do site furin é a linhagem HKU5, isolada pela equipe Shi Zhengli em 2014 em Guangzhou de morcegos do gênero Pipistrellus (adicionado ao GenBank em 2018). Mas ele é um parente muito distante - suas proteínas semelhantes a espículas coincidem apenas em 36%.

Em geral, os cientistas estão confusos. De onde veio essa inserção de 12 nucleotídeos? Poderia ser feito pelo homem? Bastante. De fato, os virologistas lidam com essas inserções repetidamente e desde os tempos antigos. Por exemplo, os americanos inseriram o RRSRR na proteína spike da primeira SARS-CoV em 2006 :
Para investigar se a clivagem proteolítica na sequência dos principais resíduos de aminoácidos pode promover a atividade de fusão celular, modificamos a proteína SARS-CoV semelhante a espiga para criar um local de reconhecimento de furina (RRSRR) em um dos dois locais.
Texto original
To investigate whether proteolytic cleavage at the basic amino acid residues, were it to occur, might facilitate cell–cell fusion activity, we mutated the wild-type SARS-CoV glycoprotein to construct a prototypic furin recognition site (RRSRR) at either position.

E os japoneses inseriram esse site (RRKR) na proteína SARS-CoV em 2008, embora um pouco a jusante:


No mesmo ano de 2008, seus colegas holandeses também estudaram esses locais de protease na SARS-CoV e os compararam com o coronavírus murino MHV, que possui este site (SRRAHR | SV), além disso, semelhante ao site do nosso CoV2 (SPRRAR | SV):


Em 2009, outro grupo americano também decidiu praticar “melhorar” o SARS-CoV e, sem alterar a tradição americana de não brincar com argininas, eles inseriram o RRSRR :
Para investigar o uso potencial das posições SARS-CoV S1-S2 e S2 'como locais de clivagem proteolítica, introduzimos primeiro os locais de reconhecimento de clivagem de furina nesses locais, fazendo as seguintes mutações 664-SLLRSTSQSI - SLL RRSRR SI-671 (S1-S2) e 792-LKPTKRSF-LKRTKRSF-799 (S2 ').
Texto original
To examine the potential use of the SARS-CoV S1–S2 and S2? positions as sites for proteolytic cleavage, we first introduced furin cleavage recognition sites at these locations by making the following mutations 664-SLLRSTSQSI — SLLRRSRRSI-671 (S1–S2) and 792-LKPTKRSF — LKRTKRSF-799 (S2?).

Pequim 2019


Mas o trabalho semelhante mais recente que vi foi o de outubro de 2019 por cientistas de Pequim, onde o novo site de furina RRKR foi inserido não em alguns pseudovírus, mas no verdadeiro coronavírus de galinha, vírus da bronquite infecciosa (IBV):


A propósito, é interessante mencionar os autores que a adição de um local de furina permite ao vírus mutante infectar células nervosas. Talvez seja o local da CoV2 furin que faz com que alguns pacientes com CoV2 exibam sintomas neurológicos , incluindo perda de olfato:
S2' QX , , IBV (WT-IBV). , IBV S2 ( -S2) . IBV .
…
, , FP CoV, , , -, , .
Mutation of the S2' site of QX genotype (QX-type) spike protein (S) in a recombinant virus background results in higher pathogenicity, pronounced neural symptoms and neurotropism when compared with conditions in wild-type IBV (WT-IBV) infected chickens. In this study, we present evidence suggesting that recombinant IBV with a mutant S2' site (furin-S2' site) leads to higher mortality. Infection with mutant IBV induces severe encephalitis and breaks the blood–brain barrier.
…
In summary, our results demonstrate that the furin cleavage site upstream of the FP in S protein is an important site for CoV, modulating entry, cell–virus fusion, adaptation to its host cell, cell tropism and pathogenicity, but not antigenicity.
Além disso, muitos coronavírus têm sítios de furina, é claro, encontrados na natureza e são muito diversos. Sim, e eles podem aparecer como resultado de mutações aleatórias. Foi exatamente o que aconteceu no caso do MERS, que nos foi contado em 2015 por uma equipe internacional de autores , entre os quais Shi Zhengli e Ralph Barik, duas estrelas da coronavirusologia sintética. Vamos lembrá-los mais de uma vez, mas por enquanto algumas palavras sobre esse artigo. Na verdade, os autores mostraram duas principais mutações que permitiram ao MERS pular de morcegos para humanos. E uma dessas mutações levou ao surgimento de um local de furina. É verdade que não se tratava de uma caixa de novos aminoácidos, mas de mutações dos já existentes (marcados em vermelho abaixo):


Os autores não apenas mostraram, mas anexaram essas mutações à proteína original do bastão de morcego, criando as mesmas mutações (ou seja, o local da furina) e mostrando que isso lhe dá a capacidade de infectar células humanas:
, HKU4 , HKU4, . , S746R N762A, HKU4.
…
, hPPC hECP HKU4 HKU4 . , HKU4 S1/S2, .
To evaluate the potential genetic changes required for HKU4 to infect human cells, we reengineered HKU4 spike, aiming to build its capacity to mediate viral entry into human cells. To this end, we introduced two single mutations, S746R and N762A, into HKU4 spike. The S746R mutation was expected to restore the hPPC motif in HKU4 spike, whereas the N762A mutation likely disrupted the potential N-linked glycosylation site in the hECP motif in HKU4 spike.
…
Therefore, the reengineered hPPC and hECP motifs enabled HKU4 spike to be activated by human endogenous proteases and thereby allowed HKU4 pseudoviruses to bypass the need for exogenous proteases to enter human cells. These results reveal that HKU4 spike needs only two single mutations at the S1/S2 boundary to gain the full capacity to mediate viral entry into human cells.
A propósito, como eles fizeram isso pode assustar as pessoas que estão longe da biotecnologia moderna - porque os autores inseriram essa proteína semelhante ao pico de coronavírus no retrovírus inativado (HIV):
Resumidamente, retrovírus pseudotipados com pico de MERS-CoV que expressam o gene repórter da luciferase foram obtidos por cotransfecção de células HEK293T com um plasmídeo portador do gene HIV-1, luciferase que expressa o defeito no Env (pNL4-3.luc.RE-) e um plasmídeo que codifica MERS Proteína de pico de CoV.
Texto original
Briefly, MERS-CoV-spike-pseudotyped retroviruses expressing a luciferase reporter gene were prepared by cotransfecting HEK293T cells with a plasmid carrying Env-defective, luciferase-expressing HIV-1 genome (pNL4–3.luc.R-E-) and a plasmid encoding MERS-CoV spike protein.
Talvez tenha sido isso que levou os pesquisadores indianos a procurar sequências semelhantes no HIV e CoV2 no genoma (mas sua pré-impressão foi rapidamente criticada pela metodologia malsucedida e conclusões errôneas). De fato, os especialistas usam esses pseudovírus regularmente e, em geral, não se deve ficar indiferente ao medo dos retrovírus como uma classe - suas subespécies lentivírus têm sido usadas para terapia genética há muitos anos.

De onde veio o RaTG13


Em geral, o RaTG13 é uma tensão fenomenal. É estranho que todos esses anos, o grupo de Shi Zhengli tenha ficado em silêncio sobre ele. Afinal, ele não se parece em nada com seus outros irmãos, especialmente na sequência da proteína do tipo espiga, e este, eu me lembro, é precisamente o lugar que determina a que tipos de células (e quais tipos) esse vírus pode se apegar. Aqui está um gráfico da similaridade do genoma de CoV2 em comparação com outros coronavírus de morcego (painel B):


RaTG13 é a curva vermelha e azul são as deformações mais próximas a RaTG13 (ZXC21 e ZC45). Essas cepas foram isoladas de ferraduras chinesas ( Rhinolophus sinicus ) em Zhoushan em 2015 ( ZXC21 ) e 2017 ( ZC45 ). Como pode ser visto no gráfico, mesmo eles diferem muito fortemente do RaTG13 (curva vermelha) na região da proteína S. Ao mesmo tempo, o gráfico acima não transmite tão bem a escala do abismo entre eles como uma comparação direta de sequências:


Como você pode ver, as proteínas do tipo espigão ZXC21 e ZC45 geralmente não são apenas 23-24 resíduos de aminoácidos mais curtas que a proteína RaTG13, mas são mais curtas no lugar mais importante - no RBM (veja exclusões na caixa vermelha marcada com traços vermelhos).

Então, de onde veio o RaTG13? Como eu disse, em 2020, Shi Zhengli disse que o isolou de morcegos-ferradura (apenas as espécies Rhinolophus affinis , não R. sinicus ) em julho de 2013 em Yunnan. É verdade que até o final de janeiro de 2020, sua existência não era divulgada publicamente, mas como o próprio grupo Shi Zhengli descreve sua descoberta significativa sobre sua semelhança com o CoV2 :
, - - (RdRp) (BatCoV RaTG13), Rhinolophus affinis , 2019-CoV2. ( GISAID EPI_ISL_402131). Simplot , 2019-CoV2 RaTG13 (Fig. 1c), 96,2%.
We then found that a short region of RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) from a bat coronavirus (BatCoV RaTG13) — which was previously detected in Rhinolophus affinis from Yunnan province — showed high sequence identity to 2019-CoV2. We carried out full-length sequencing on this RNA sample (GISAID accession number EPI_ISL_402131). Simplot analysis showed that 2019-CoV2 was highly similar throughout the genome to RaTG13 (Fig. 1c), with an overall genome sequence identity of 96.2%.
Não espessa: bem, eles tinham essa cepa "descoberta anteriormente" , e era. Deitado em uma prateleira. Até 2020, apenas a parte do genoma responsável pelo RdRp era sequenciada nele. De onde ele veio na prateleira? Em Yunnan em 2013 alocado. Onde exatamente? Eles não disseram. No GenBank , também, não possuía essa informação. Felizmente, porém, havia um GISAID no banco de dados do genoma: é relatado que na cidade de Puer (sim, na terra natal do amado chá de Basta), um homem foi isolado do swab fecal:


Isso me intrigou um pouco, porque nas minhas andanças por Pabmed, eu já havia tropeçado em uma expedição a Puer no verão de 2013 :
Os morcegos foram capturados em vários locais em cinco distritos das quatro prefeituras de Yunnan, China, de maio a julho de 2013.
Texto original
Bats were captured from various locations in five counties of four prefectures of Yunnan Province, China, from May to July 2013.

Os pesquisadores não acharam nada particularmente interessante para nós nessa expedição, mas talvez tenha sido então que Shi Zhengli (ou alguém do seu grupo?) Identificou a mesma amostra de RaTG13? Eles sequenciaram apenas parcialmente, mas por algum motivo decidiram não publicar, embora fosse muito diferente de tudo o que se sabia anteriormente.

A própria Shi Zhengli poderia participar pessoalmente dessa expedição, porque falou muito calorosamente sobre tais expedições - por exemplo, em sua performance do tipo TED em 2018, onde mostrou suas fotos de tais expedições:



Foi uma série de expedições que trouxeram sua fama mundial e o apelido de "Batumen": em um artigo de 2013 na Nature , o grupo Shi Zhengli anunciou triunfantemente que nas cavernas de Yunnan havia descoberto morcegos portadores das linhagens RsSHC014 e Rs3367 que coincidiam com os primeiros SARS. -CoV em 85% e 96%, respectivamente.

A propósito, é uma coincidência engraçada que, ao mesmo tempo, no mesmo Yunnan, o grupo Shi Zhengli também tenha encontrado a cepa RaTG13, que acabou sendo a mais próxima do CoV2, e seus genomas também coincidem 96%.

Wuhan-1


Voltando ao artigo triunfante de 2013, o grupo de Shi Zhengli também disse que, ao cultivar amostras isoladas na cultura de células de macaco Vero , eles conseguiram isolar um vírus vivo que era quase idêntico à cepa Rs3367 (mais próxima ao SARS-CoV) . Os autores apelidaram sua prole WIV1 (onde WIV significa Wuhan Institute of Virology):
Mais importante, relatamos o primeiro isolamento do vírus vivo SL-CoV (morcego SL-CoV-WIV1) de amostras isoladas de fezes de morcego em células Vero E6, que possui uma morfologia típica do coronavírus, 99,9% de identidade genômica Rs3367 e usa pessoas ACE2, civeta e ossos de ferradura para entrar na célula. Testes preliminares in vitro mostram que o WIV1 também possui amplo tropismo de espécies.
Texto original
Most importantly, we report the first recorded isolation of a live SL-CoV (bat SL-CoV-WIV1) from bat faecal samples in Vero E6 cells, which has typical coronavirus morphology, 99.9% sequence identity to Rs3367 and uses ACE2 from humans, civets and Chinese horseshoe bats for cell entry. Preliminary in vitro testing indicates that WIV1 also has a broad species tropism.
Vamos comparar o RaTG13 com as cepas Rs3367 e RsSHC014:


Como você pode ver, a proteína tipo espiga dessas cepas não é apenas menor que 13 aminoácidos RaTG13-shn, mas também difere bastante em seu primeiro trimestre. A propósito, é curioso que as proteínas spike em Rs3367 (aka WIV1) e RsSCH014 sejam quase idênticas e diferam apenas na região RBD (sequência à direita abaixo). Quase como CoV2 e RaTG13 (sem contar a inserção de furina):


Poderia algum pesquisador, depois de receber amostras de coronavírus de pangolinas confiscadas na alfândega em março de 2019, querer verificar como o pangolínio RBM é tropical para o receptor humano? E se com um site de furin polibásico no lugar mais interessante? Isso vai ser uma bomba!

Teoricamente, é claro, ele poderia. Não há nada tecnicamente difícil para os virologistas realizarem tais experimentos. Uma pergunta razoável: por que eles usariam o RaTG13 como base e ainda não testaram o WIV1? Mas é possível que eles também testaram a quimera com WIV1. E, paralelamente, eles decidiram simular a variante de recombinação do vírus pangolim com o morcego mais próximo - afinal, o RaTG13 está mais próximo das cepas de pangolim do que o WIV1: sua proteína semelhante à espiga está mais próxima deles, tanto filogeneticamente quanto estruturalmente - até os combina em comprimento, enquanto as proteínas WIV1 / Rs3367 e RsSHC014 13 aminoácidos mais curtos que o pangolim. E a mutação QTQTNS comum a RaTG13 e pangolin-19 (MP789) na região do local da protease não pode deixar indiferente o especialista.

Outras cepas de Yunnan


By the way, outros pesquisadores em 2011 também encontrou amostras de coronavírus do Yunnan Rhinolophus affinis A tensão LYRa11 pareceu-me o mais interessante.:


Mas também está muito longe do RaTG13 e muito mais próximo do Rs3367 (esta é a cepa que 96% coincide com o primeiro SARS-CoV):


Mas o RaTG13, isolado dos mesmos morcegos de Rhinolophus affinis que o LYRa11, parece menos com ele (explosão à esquerda).

E, finalmente, outra cepa de Yunnan (engenhosamente chamada Yunnan2011), isolada em 2011 de outra subespécie da corrida de ferraduras, Rhinolophus pusillus , é semelhante ao RaTG13 ainda menos que ao LYRa11:


Sim, e entre si, Yunnan2011 e LYRa11 (a explosão correta acima) não são particularmente semelhantes, além da região S2 altamente conservada. A propósito, que tipo de bagunça eles têm com os nomes das cepas? Primeiro, eles prescrevem durante todo o ano, às vezes parcialmente, ou mesmo nem sequer (Rs3367). Primeiro vem o tipo de transportadora ( Ra TG13) e depois (LY Ra 11). Ainda querendo saber o que significa TG, LY ou SHC? Iniciais descriptografando o genoma?

Tudo bem, vamos passar da arqueologia viral para a engenharia viral, a saber, o transplante de áreas-chave da proteína spike e outros experimentos de ganho de função (GOF).

1999: Primeiro coronavírus quimérico


Se você acha que todo esse mecanismo GOF com a análise do que exatamente permite que os coronavírus pulem de uma espécie para outra começou em resposta à epidemia da primeira SARS em 2002, você está enganado. Os virologistas experimentaram coronavírus quiméricos muito antes disso. Aqui está, por exemplo, um artigo de amostra de 1999 do grupo holandês Peter Rottier de Utrecht com o ditado "Redirecionando o coronavírus substituindo o ectodomain na proteína spike: atravessando a barreira das espécies":
Usando recombinação de RNA direcionada, construímos um mutante do vírus da hepatite de camundongo coronavírus (MHV), no qual o ectodomain da proteína pontiaguda foi substituído pelo ectodomain altamente divergente da proteína do vírus da peritonite infecciosa felina. O vírus quimérico resultante, designado fMHV, adquiriu a capacidade de infectar células felinas e, ao mesmo tempo, perdeu a capacidade de infectar células de camundongo em cultura.
Texto original
Using targeted RNA recombination, we constructed a mutant of the coronavirus mouse hepatitis virus (MHV) in which the ectodomain of the spike glycoprotein (S) was replaced with the highly divergent ectodomain of the S protein of feline infectious peritonitis virus. The resulting chimeric virus, designated fMHV, acquired the ability to infect feline cells and simultaneously lost the ability to infect murine cells in tissue culture.
A propósito, Shi Zhengli parece ter tido um estágio sob Peter Rottier em Utrecht. Pelo menos em 2005, ela foi coautora de um artigo conjunto em que Utrecht foi listada como sua afiliada (mas o endereço atual já estava indicado no Instituto de Xangai). A propósito, o artigo em si também é muito curioso - nele os autores investigaram o que exatamente permite que os vírus expandam o tropismo de suas espécies:
Apenas um pequeno número de mutações em sua proteína do tipo espiga permite que o coronavírus do rato mude do tropismo limitado pelo mouse para um intervalo estendido de hospedeiros por passivação in vitro. Um desses vírus que estudamos adquiriu dois locais putativos de ligação ao sulfato de heparano, enquanto preservava o local da furina em outro local.
Texto original
Only a relatively few mutations in its spike protein allow the murine coronavirus to switch from a murine-restricted tropism to an extended host range by being passaged in vitro. One such virus that we studied had acquired two putative heparan sulfate-binding sites while preserving another site in the furin-cleavage motif.
Em primeiro lugar, é interessante que o local da furina nesse vírus (SRRAHR | SV) seja semelhante ao local em CoV2 (SPRRAR | SV), embora corta mais eficientemente em CoV2 devido a argininas duplas (isso o torna um local polibásico , ou seja, ele possui vários aminoácidos básicos seguidos na sequência RxxR ):


Mas o artigo é especialmente curioso que as mutações que permitiram ao vírus "ampliar seus horizontes" nem sequer ocorreram em animais de laboratório, mas in vitro ( por serem passadas in vitro ). E, ao que parece, eles aconteceram muito rapidamente:
MHV/pi23 — , 23 600 , MHV/BHK, HS- S1 , MHV/BHK, , HS- . MHV/pi23 , , MHV/BHK. HS- , , , S, HR1 (Fig. 1), . S, .
MHV/pi23, a virus obtained after 23 of the 600 passages that resulted in MHV/BHK, also contains a putative HS-binding site in the S1 domain at the same position as in MHV/BHK, albeit as a smaller insertion, while it lacks the putative HS-binding site immediately upstream of the fusion peptide. MHV/pi23 does infect nonmurine cells to some extent but much less efficiently than MHV/BHK. In addition to the multiple HS-binding sites, however, mutations found in other parts of the S protein, such as the HR1 domain and the putative fusion peptide (Fig. 1), might also contribute to the efficient entry into nonmurine cells. We are currently in the process of determining the S protein mutations that are required for the extended host range phenotype.
No futuro, mencionarei que houve outros grupos que tentaram mutações in vitro para aumentar a virulência do coronavírus, por exemplo, MERS:
Para entender melhor a adaptabilidade das espécies MERS-CoV, usamos a variante DPP4 abaixo do ideal para estudar a adaptação viral. A passagem do vírus nas células que expressam essa variante de DPP4 resultou no acúmulo de mutações na proteína de pico viral, o que aumentou a replicação.
Texto original
To better understand the species adaptability of MERS-CoV, we identified a suboptimal species-derived variant of DPP4 to study viral adaption. Passaging virus on cells expressing this DPP4 variant led to accumulation of mutations in the viral spike which increased replication.
Além disso, suas mutações já ocorreram após várias passagens (rodadas de reprodução das culturas celulares):

(F) Esquema do aparecimento de mutações simples e duplas na proteína espiga MERS-CoV em diferentes passagens.
(G) Localização das mutações na proteína spike MERS-CoV.
Texto original
(F) Schematic of single and double mutation emergence in MERS-CoV spike over different passages.
(G) Location of mutations within MERS-CoV spike.
Mas tudo isso será muito mais tarde. Enquanto isso, voltemos a 2002 - ANTES do surto do primeiro SARS-CoV.

Como Barik iluminou o caminho para todos


Ralph Barik é uma lenda na coronavírus. Um verdadeiro pioneiro nas técnicas de manipulação de genoma viral sintético. Em 2002, ele publicou um trabalho inovador que abriu um novo marco, tanto no estudo de vários mecanismos de vírus naturais quanto na pesquisa de ganho de função (GOF). Em seu trabalho , o grupo de Barik recriou sinteticamente um clone do coronavírus natural do rato:
II 59 (MHV-A59). , MHV 31,5 . , MHV-A59 ~ 31,5 ... , , , … , , .
Texto original
A novel method was developed to assemble a full-length infectious cDNA of the group II coronavirus mouse hepatitis virus strain A59 (MHV-A59). Seven contiguous cDNA clones that spanned the 31.5-kb MHV genome were isolated. The ends of the cDNAs were engineered with unique junctions and assembled with only the adjacent cDNA subclones, resulting in an intact MHV-A59 cDNA construct of ?31.5 kb in length. The interconnecting restriction site junctions that are located at the ends of each cDNA are systematically removed during the assembly of the complete full-length cDNA product, allowing reassembly without the introduction of nucleotide changes… The method has the potential to be used to construct viral, microbial, or eukaryotic genomes approaching several million base pairs in length and used to insert restriction sites at any given nucleotide in a microbial genome.

Ou seja, os autores, de fato, traduziram o vírus RNA para a linguagem do DNA (usando a transcriptase reversa), para que seria conveniente manipular seu genoma usando as ferramentas de engenharia genética existentes. Depois de criar 7 desses segmentos de provírus de cDNA, os autores os juntaram “sem costura” (sem deixar vestígios), após o que transferiram sua construção de volta ao RNA, a partir do qual partículas virais foram formadas em outras células.

SARS-2003


Apenas algumas semanas após a publicação desse trabalho pelo grupo de Barik, a epidemia de SARS-CoV ocorreu e Ralph Barik não perdeu tempo. Já no verão de 2003, seu grupo enviou para imprimir o trabalho de criação de um clone sintético SARS-CoV:
, , SARS-CoV Urbani SARS ( SARS-CoV), , . , , … SARS-CoV , .
Using a panel of contiguous cDNAs that span the entire genome, we have assembled a full-length cDNA of the SARS-CoV Urbani strain, and have rescued molecularly cloned SARS viruses (infectious clone SARS-CoV) that contained the expected marker mutations inserted into the component clones. Recombinant viruses replicated as efficiently as WT virus and both were inhibited by treatment with the cysteine proteinase inhibitor… Availability of a SARS-CoV full-length cDNA provides a template for manipulation of the viral genome, allowing for the rapid and rational development and testing of candidate vaccines and therapeutics against this important human pathogen.

A velocidade do grupo Barik nos permite entender com que rapidez uma equipe qualificada de virologistas pode criar um clone sintético a partir de um vírus natural e, portanto, fazer modificações genéticas nele. E foi em 2003. Hoje, todo o mesmo laboratório qualificado pode repetir em questão de semanas.

SARS-2006


Barik foi o primeiro, mas longe do último. A engenharia genética se desenvolveu aos trancos e barrancos, criando mais e mais novas ferramentas. Outros grupos praticaram tecnologias alternativas de virologia sintética. Por exemplo, em 2006, pesquisadores espanhóis repetiram as conquistas de Barik, criando também um clone sintético de SARS , mas usando outra tecnologia ( cromossomo bacteriano artificial ):
Urbani SARS-CoV (BAC). . , Escherichia coli.
…
SARS-CoV E.coli DH10B 200 , ( ). .
The engineering of a full-length infectious cDNA clone and a functional replicon of the severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) Urbani strain as bacterial artificial chromosomes (BACs) is described in this study. In this system, the viral RNA was expressed in the cell nucleus under the control of the cytomegalovirus promoter and further amplified in the cytoplasm by the viral replicase. Both the infectious clone and the replicon were fully stable in Escherichia coli.
…
The assembled SARS-CoV infectious cDNA clone was fully stable during its propagation in E. coli DH10B cells for more than 200 generations, considerably facilitating the genetic manipulation of the viral genome (data not shown). The detailed cloning strategy, plasmid maps, and sequences are available upon request.

É verdade que eles não fizeram isso com a mesma elegância que Barik, pois na montagem final do vírus sintético ainda haviam adicionado sites de enzimas de restrição, enquanto Barik aprendeu a combinar os fragmentos "perfeitamente". Mas essas são insignificantes, a abordagem dos espanhóis também está funcionando: em 2013, com a ajuda deles, eles criaram um clone sintético do MERS-a e, em 2015, sua técnica foi incluída no manual do coronavírus (capítulo 13):


Wuhan 2007


Mas em 2007. Então, o grupo Shi Zhengli se juntou à corrida de virologia sintética com um estudo da proteína do tipo espiga dos coronavírus humanos e de morcegos, tentando determinar o que exatamente é responsável pela capacidade de pular de uma espécie para outra:
Um número de proteínas de pico quiméricas foram construídas através da inserção de várias sequências de proteínas de pico de SARS-CoV na espinha dorsal da proteína SL-CoV.
Texto original
A series of S chimeras was constructed by inserting different sequences of the SARS-CoV S into the SL-CoV S backbone.
Ou seja, os autores inseriram diferentes segmentos da proteína SARS-CoV humana na proteína do vírus morcego. Aqui está a conclusão deles:
A partir desses resultados, verificou-se que a região de 310 a 518 na proteína spike BJ01 era necessária e suficiente para obter a capacidade da proteína spike Rp3 de se ligar à ACE2 humana.
Texto original
From these results, it was deduced that the region from aa 310 to 518 of BJ01-S was necessary and sufficient to convert Rp3-S into a huACE2-binding molecule.
Ao mesmo tempo, eles tentaram substituir fragmentos mais curtos, incluindo apenas o RBM:
Para inserir RBM de SARS-CoV na proteína spike SL-CoV, a região codificadora de 424 a 494 aminoácidos na proteína spike BJ01 foi usada para substituir as regiões correspondentes na proteína Rp3, resultando em um gene quimérico da proteína spike (CS), designado como CS424 –494
Texto original
For introduction of the RBM of SARS-CoV S into the SL-CoV S, the coding region from aa 424 to 494 of BJ01-S was used to replace the corresponding regions of Rp3-S, resulting in a chimeric S (CS) gene designated CS424–494.
Como foi escrito em 2007, acho que hoje não será difícil, mesmo para um virologista iniciante, substituir a RBM de um vírus por outro.

Chimera 2015


À luz das experiências acima, não está muito claro o que exatamente causou a sensação que a publicação de ganho de função provavelmente mais sensacional produziu. Obviamente, trata-se do trabalho conjunto de Shi Zhengli e Ralph Barik, no qual eles criaram um vírus quimérico sintético:
SARS-CoV, , SHC014 SARS-CoV. , 2b, SHC014 , SARS (ACE2), in vitro, SARS-CoV. , in vivo . ; , CoV . SHC014 in vitro, in vivo.
Texto original
Using the SARS-CoV reverse genetics system, we generated and characterized a chimeric virus expressing the spike of bat coronavirus SHC014 in a mouse-adapted SARS-CoV backbone. The results indicate that group 2b viruses encoding the SHC014 spike in a wild-type backbone can efficiently use multiple orthologs of the SARS receptor human angiotensin converting enzyme II (ACE2), replicate efficiently in primary human airway cells and achieve in vitro titers equivalent to epidemic strains of SARS-CoV. Additionally, in vivo experiments demonstrate replication of the chimeric virus in mouse lung with notable pathogenesis. Evaluation of available SARS-based immune-therapeutic and prophylactic modalities revealed poor efficacy; both monoclonal antibody and vaccine approaches failed to neutralize and protect from infection with CoVs using the novel spike protein. On the basis of these findings, we synthetically re-derived an infectious full-length SHC014 recombinant virus and demonstrate robust viral replication both in vitro and in vivo.
Ou seja, os pesquisadores já estavam no caminho batido: pegaram a proteína do tipo RsSHC014, que Shi Zhengli isolou de morcegos Yunnan em 2011, e a inseriu no SARS-CoV, especialmente adaptado para ratos rastejantes, para experimentos subsequentes in vivo nesses mesmos ratos. Bem, nas células humanas, um novo design foi testado. E, ao mesmo tempo, praticamos a criação de um clone recombinante do mesmo RsSHC014 - bem, por que não? Afinal, em primeiro lugar, é lindo:

(a) Esquema do clone molecular SHC014-CoV, que foi sintetizado na forma de seis segmentos de cDNA contíguos (designados como SHC014A, SHC014B, SHC014C, SHC014D, SHC014E e SHC014F) ladeados por locais únicos de enzimas de restrição BglI que forneciam montagem direcional para DNA 1a, 1b, espiga, 3, envelope, matriz, 6-8 e nucleocapsídeo). Os nucleotídeos sublinhados são sequências salientes formadas após a digestão com enzimas de restrição.
Texto original
(a) Schematic of the SHC014-CoV molecular clone, which was synthesized as six contiguous cDNAs (designated SHC014A, SHC014B, SHC014C, SHC014D, SHC014E and SHC014F) flanked by unique BglI sites that allowed for directed assembly of the full-length cDNA expressing open reading frames (for 1a, 1b, spike, 3, envelope, matrix, 6–8 and nucleocapsid). Underlined nucleotides represent the overhang sequences formed after restriction enzyme cleavage.
Em segundo lugar, os pesquisadores perceberam que não é apenas pela natureza da proteína do tipo espigão para o receptor que é determinado o potencial de transição do vírus de uma espécie animal para outra - porque a quimera SHC014-MA15 era mais virulenta que o SHC014, mesmo nas células humanas:
Vale ressaltar que o tropismo diferencial nos pulmões comparado ao SARS-MA15 e o enfraquecimento do SHC014-CoV de comprimento total em culturas [vias aéreas epiteliais humanas] em relação ao SARS-CoV Urbani sugerem que, além da ligação ao ACE2, outros fatores - incluindo a processabilidade da proteína spike , biodisponibilidade do receptor ou antagonismo das respostas imunes do hospedeiro - podem contribuir para a virulência.
Texto original
Notably, differential tropism in the lung as compared to that with SARS-MA15 and attenuation of full-length SHC014-CoV in [human epithelial airway cell] cultures relative to SARS-CoV Urbani suggest that factors beyond ACE2 binding — including spike processivity, receptor bio-availability or antagonism of the host immune responses — may contribute to emergence.
Quero destacar especialmente a processabilidade da proteína spike na citação, porque não é a primeira vez que os pesquisadores escrevem que a capacidade da proteína spike de clivar proteases (incluindo furina) tem um efeito significativo na virulência.

Em conclusão, o tema é uma foto conjunta de Ralph Barik e Shi Zhengli. Foto tirada em Wuhan, em outubro de 2018:



Mouse SARS-2007


Aqui não posso deixar de mencionar que tipo de "vírus de mouse MA15" era em um trabalho anterior. Isso não é de todo algum tipo de coronavírus natural do mouse, como se pode sugerir. E este é um SARS-CoV humano modificado em laboratório, que em 2007, o mesmo grupo Barik - aparentemente competindo com o grupo Shi Zhengli (lembre-se do artigo de 2007) - se transformou em um verdadeiro assassino . Para fazer isso, eles primeiro “melhoraram” iterativamente em camundongos e, após várias iterações, tornaram-se “efetivamente” máximos, eles reproduziram as mutações que surgiram em camundongos no clone sintético de um novo vírus e mais uma vez verificaram se realmente havia aumentado a infectividade:
SARS-CoV ( Urbani) BALB/c. (MA15), . , , , . , . , , 15, , . MA15 , ; SARS-CoV (rMA15), MA15. 15 , SARS .
We adapted the SARS-CoV (Urbani strain) by serial passage in the respiratory tract of young BALB/c mice. Fifteen passages resulted in a virus (MA15) that is lethal for mice following intranasal inoculation. Lethality is preceded by rapid and high titer viral replication in lungs, viremia, and dissemination of virus to extrapulmonary sites accompanied by lymphopenia, neutrophilia, and pathological changes in the lungs. Abundant viral antigen is extensively distributed in bronchial epithelial cells and alveolar pneumocytes, and necrotic cellular debris is present in airways and alveoli, with only mild and focal pneumonitis. These observations suggest that mice infected with MA15 die from an overwhelming viral infection with extensive, virally mediated destruction of pneumocytes and ciliated epithelial cells. The MA15 virus has six coding mutations associated with adaptation and increased virulence; when introduced into a recombinant SARS-CoV, these mutations result in a highly virulent and lethal virus (rMA15), duplicating the phenotype of the biologically derived MA15 virus. Intranasal inoculation with MA15 reproduces many aspects of disease seen in severe human cases of SARS.

-2008


Falando da rivalidade de Barik e Shi Zhengli. Paralelamente ao transplante de RBD de SARS-CoV humano para murino, seu grupo criou as mesmas quimeras com cepas de morcegos. Em 2008, o grupo de Barik pegou a cepa Bat-SCoV e a substituiu por RBD em uma proteína de pico com RBD da SARS humana. Na verdade, ela repetiu o trabalho de Shi Zhengli de 2007, não apenas se limitando a pseudo-vírus, mas criando um coronavírus quimérico real - não apenas um murino como no trabalho de 2015, mas o mais humano. Os autores estavam claramente orgulhosos de sua conquista:
, 29,7 — (Bat-SCoV), (SARS), SARS-CoV.
…
, RBDs Bat-SCoV SARS-CoV , RBD Bat-SCoV ( 323–505) RBD SARS-CoV ( 319–518) (27, 28) (GenBank FJ211860), , in vivo (Fig. 1B).
Here, we report the design, synthesis, and recovery of the largest synthetic replicating life form, a 29.7-kb bat severe acute respiratory syndrome (SARS)-like coronavirus (Bat-SCoV), a likely progenitor to the SARS-CoV epidemic.
…
To test whether the RBDs of Bat-SCoV and SARS-CoV were interchangeable, we replaced the Bat-SCoV RBD (amino acid 323–505) with the SARS-CoV RBD (amino acid 319–518) (27, 28) (GenBank accession no. FJ211860), simulating a theoretical recombination event that might occur during mixed infection in vivo (Fig. 1B).
(B) , SARS-CoV Bat-SCoV. . Bat-SRBD Bat-SCoV, , RBD Bat-SCoV ( Bat-SCoV 323–505) RBD SARS-CoV ( 319–518) ( GenBank FJ211860 ). Bat-SRBD-MA RBD MA15 SARS-CoV Y436H. Bat-SRBM 13 SARS-CoV, ACE2, RBD 323I-429T Bat-SCoV 426R-518D SARS-CoV. Bat-Hinge Bat-SRBM, Bat-SCoV 392L-397E SARS-CoV 388V-393D. Bat-F 1–24057 SARS-CoV ( 855 ) 3'- Bat-SCoV. 1- (P1). ND , .
Texto original
(B) Schematic representation showing organization of the SARS-CoV and Bat-SCoV Spike proteins. The engineered Spike proteins are pictured below with the virus name to the left. Bat-SRBD includes all of the Bat-SCoV Spike sequence except that the Bat-SCoV RBD (Bat-SCoV amino acid 323–505) is replaced with the SARS-CoV RBD (amino acid 319–518) (GenBank accession no. FJ211860). Bat-SRBD-MA includes the MA15 Spike RBD change at SARS-CoV aa Y436H. Bat-SRBM includes the minimal 13 SARS-CoV residues critical for ACE2 contact, resulting in a chimeric RBD of Bat-SCoV amino acid 323I-429T and SARS-CoV amino acid 426R-518D. Bat-Hinge is Bat-SRBM sequence, with Bat-SCoV amino acid 392L-397E replaced with SARS-CoV amino acid 388V-393D. Bat-F includes nt 1–24057 of SARS-CoV (to Spike amino acid 855), with the remaining 3? sequence from Bat-SCoV. To the right of the schematic representations, observation of transcript activity and approximate stock titers at passage 1 (P1) are indicated. ND indicates no infectious virus detected by plaque assay.

Barik 2016


No trabalho de Barik em geral, existem muitos remakes. Por exemplo, em 2016, o ano em que ele quase repetiu o mesmo trabalho com Shi Chzhenli em 2015 para criar um vírus quimérico, mas desta vez ele colocou a proteína espinhosa myshinoadaptirovanny SARS, não da RsSCH014, e de outra encontrada Shi Chzhenli em Yunnan . parente próximo - Rs3367. Ou, para ser exato, da cepa WIV1, um clone de laboratório de Rs3367 cultivado em cultura de células no Instituto Wuhan de Virologia em 2013. Aqui está exatamente o que o grupo de Barik fez em 2016:
SARS-CoV (7), WIV1-CoV, , , , (. S1A). WIV1-CoV, SARS WIV1 (WIV1-MA15, . S1B). … Vero SARS-CoV Urbani, WIV1-MA15 WIV1-CoV.
Using the SARS-CoV infectious clone as a template (7), we designed and synthesized a full-length infectious clone of WIV1-CoV consisting of six plasmids that could be enzymatically cut, ligated together, and electroporated into cells to rescue replication competent progeny virions (Fig. S1A). In addition to the full-length clone, we also produced WIV1-CoV chimeric virus that replaced the SARS spike with the WIV1 spike within the mouse-adapted backbone (WIV1-MA15, Fig. S1B). … To confirm growth kinetics and replication, Vero cells were infected with SARS-CoV Urbani, WIV1-MA15, and WIV1-CoV.

Ou seja, em geral, em 2016, Barik clonou seu artigo a partir de 2015. Além disso, seu significado não é muito claro para mim: afinal, o WIV1 / Rs3367, se você se lembra, já 96% coincide com o SARS-CoV (por isso Shi Zhengli ganhou fama). Portanto, por que não está muito claro para mim inserir uma proteína tipo espiga do seu parente mais próximo de volta ao SARS-CoV. Talvez apenas por amor à arte. Sob esse prisma, o título de seu artigo adquire certa dualidade: “O WIV1-CoV do tipo SARS está pronto para a transição para os seres humanos” . Por alguma razão, esse quadro vem à mente imediatamente:


Ainda não entendo como, em 2015, Barik conseguiu obter uma patente para a criação de "proteínas quiméricas do tipo coronavírus", levando em consideração o fato de ele e Shi Zhengli terem publicado tudo isso antes de 2015.

Barik 1990


Ok, o toque final no retrato de Ralph Barik. Ele não era apenas um veterano nessa área, mas estava envolvido no projeto de coronavírus recombinantes mesmo antes de qualquer sequenciador e outras ferramentas modernas de engenharia genética. Aqui está seu artigo sobre a criação de "mutantes de temperatura" a partir do coronavírus de camundongos a partir do ano de 1990:
Ao longo deste estudo, o vírus da hepatite de camundongo cepa A59 (MHV-A59) foi usado. O vírus foi propagado e clonado três vezes em uma linha celular contínua de astrocitoma de camundongo (DBT).
...
Várias combinações de mutantes sensíveis à temperatura foram misturadas e inoculadas em células com uma multiplicidade de infecção igual a 10.
Texto original
The A59 strain of mouse hepatitis virus (MHV-A59) was used throughout the course of this study. Virus was propagated and cloned three times in the continuous murine astrocytoma cell line (DBT).
…
Various combinations of ts mutants were mixed and inoculated onto cells at a multiplicity of infection of 10 each.
Então Barik cria vários mutantes virais há mais de 30 anos.

Barik 2019


E, a propósito, mesmo agora, o ritmo não diminui. No final de outubro de 2019, seu grupo enviou para publicação outro artigo sobre o importante papel do local da furina na proteína spike para superar a “barreira à infecção zoonótica” pelos coronavírus:
Juntos, esses resultados demonstram que a clivagem da protease também é uma grande barreira para a infecção de células Vero pelo HKU5-CoV. Olhando mais adiante, comparamos a clivagem prevista na borda S1 / S2, S2 'e o local endossômico da protease de cisteína nas proteínas do tipo MERS, PDF2180 e HKU5 (Fig. 6D) (26). No local S1 / S2, MERS, Uganda e HKU5 mantêm o local de clivagem RXXR, embora vários aminoácidos internos possam afetar sua eficácia. Para a sequência S2 ', MERS e HKU5 também retêm o motivo RXXR; no entanto, a primeira arginina (SNAR) está ausente nos picos da cepa de Uganda, o que potencialmente afeta sua clivagem.
Texto original
Together, these results demonstrate that protease cleavage is also the primary barrier to infection of Vero cells with HKU5-CoV. Examining further, we compared the predicted cleavage at S1/S2 border, S2’, and the endosomal cysteine protease site across MERS, PDF2180, and HKU5 spikes (Fig. 6D) (26). For the S1/S2 site, MERS, Uganda, and HKU5 maintain the RXXR cleavage motif, although the different interior amino acids may alter efficiency. For the S2’ sequence, MERS and HKU5 also retain the RXXR motif; however, the Uganda spike lacks the first arginine (SNAR), potentially impacting cleavage.
Ciente do espírito competitivo entre os grupos de Barik e Shi Zhengli, pergunto-me qual é a probabilidade de que em Wuhan, no final de 2019, alguém também tenha feito pesquisas semelhantes?

Ganho de função: "Negar não pode continuar"


Muitos dos que ouviram falar dos estudos acima estão fazendo uma pergunta razoável: "Que diabos?" Por que os cientistas criam vírus assassinos quiméricos? Resposta politicamente correta: desenvolver proteção preventiva (vacinas e medicamentos) contra possíveis quimeras naturais e entender os riscos de sua ocorrência. Aqui, de fato, que Barik, Shi Zhengli e os co-autores escreveram sobre esse assunto no mesmo artigo de 2015:
, (GOF). (Fig. 4a, b) , SHC014-MA15, , . SHC014-MA15 SARS-CoV, , CoV Urbani MA15, , . , Urbani-MA15 CoV, SHC014-MA15 (. 1). , , , . , . GOF; . , , , .
Texto original
In addition to offering preparation against future emerging viruses, this approach must be considered in the context of the US government–mandated pause on gain-of-function (GOF) studies. On the basis of previous models of emergence (Fig. 4a,b), the creation of chimeric viruses such as SHC014-MA15 was not expected to increase pathogenicity. Although SHC014-MA15 is attenuated relative to its parental mouse-adapted SARS-CoV, similar studies examining the pathogenicity of CoVs with the wild-type Urbani spike within the MA15 backbone showed no weight loss in mice and reduced viral replication. Thus, relative to the Urbani spike–MA15 CoV, SHC014-MA15 shows a gain in pathogenesis (Fig. 1). On the basis of these findings, scientific review panels may deem similar studies building chimeric viruses based on circulating strains too risky to pursue, as increased pathogenicity in mammalian models cannot be excluded. Coupled with restrictions on mouse-adapted strains and the development of monoclonal antibodies using escape mutants, research into CoV emergence and therapeutic efficacy may be severely limited moving forward. Together, these data and restrictions represent a crossroads of GOF research concerns; the potential to prepare for and mitigate future outbreaks must be weighed against the risk of creating more dangerous pathogens. In developing policies moving forward, it is important to consider the value of the data generated by these studies and whether these types of chimeric virus studies warrant further investigation versus the inherent risks involved.
Essas palavras foram proféticas? No final de 2014, os Estados Unidos introduziram uma moratória no financiamento estatal de tais estudos de ganho de função, mas foram cancelados quase imediatamente (em 2017) . E na China, nenhuma moratória desses estudos foi introduzida e, pelo contrário, eles abriram novos “super (sem) laboratórios perigosos” do nível BSL-4, como em 2017 em Wuhan :


Só para explicar, até 2017, o laboratório do Instituto de Virologia de Wuhan era o BSL-3, o suficiente para trabalhar com coronavírus. Aqui estão algumas citações da nota acima sobre a criação do laboratório Wuhan BSL-4:
— , , BSL-4, . ; , . « ».
…
. BSL-4 ; , , , .

, , BSL-4 — , , — . « , , », — .

BSL-4 . , , , , . , , .

« », — . , : « , , ».

Trevan diz que o investimento da China no laboratório BSL-4 pode, acima de tudo, ser uma maneira de provar ao mundo que o país é competitivo. "Este é um grande símbolo de status na biologia", diz ele, "independentemente de serem necessários ou não".
Texto original
Future plans include studying the pathogen that causes SARS, which also doesn’t require a BSL-4 lab, before moving on to Ebola and the West African Lassa virus, which do. Some one million Chinese people work in Africa; the country needs to be ready for any eventuality, says Yuan. “Viruses don’t know borders.”
…
The plan to expand into a network heightens such concerns. One BSL-4 lab in Harbin is already awaiting accreditation; the next two are expected to be in Beijing and Kunming, the latter focused on using monkey models to study disease.
Lina says that China’s size justifies this scale, and that the opportunity to combine BSL-4 research with an abundance of research monkeys — Chinese researchers face less red tape than those in the West when it comes to research on primates — could be powerful. “If you want to test vaccines or antivirals, you need a non-human primate model,” says Lina.
But Ebright is not convinced of the need for more than one BSL-4 lab in mainland China. He suspects that the expansion there is a reaction to the networks in the United States and Europe, which he says are also unwarranted. He adds that governments will assume that such excess capacity is for the potential development of bioweapons.
“These facilities are inherently dual use,” he says. The prospect of ramping up opportunities to inject monkeys with pathogens also worries, rather than excites, him: “They can run, they can scratch, they can bite.”
Trevan says China’s investment in a BSL-4 lab may, above all, be a way to prove to the world that the nation is competitive. “It is a big status symbol in biology,” he says, “whether it’s a need or not.”
Curiosamente, além de Wuhan, eles planejavam abrir um novo laboratório BSL-4 em Kunming, com o objetivo de testar vacinas em primatas. Kunming, eu lembro, esta é a capital de Yunnan. Foi nas cavernas próximas que Shi Zhengli encontrou as próprias linhagens Rs3367 e RsSHC014. A propósito, o teste de primazia foi mencionado como possíveis etapas adicionais para o desenvolvimento de vacinas preventivas contra possíveis surtos futuros de coronavírus no “mesmo” (quantas vezes eu chamei assim?) Artigo de Barik e Shi Zhengli:
No entanto, mais testes em primatas não humanos são necessários para traduzir esses achados em potencial patogênico em humanos. É importante notar que a falta de agentes terapêuticos disponíveis determina a necessidade crítica de mais estudos e desenvolvimento de métodos de tratamento. Com esse conhecimento, podem ser desenvolvidos programas de vigilância, reagentes de diagnóstico e tratamentos eficazes que podem proteger contra o aparecimento de coronavírus específicos do grupo 2b, como SHC014, e podem ser aplicados a outros ramos do coronavírus que suportam grupos heterogêneos semelhantes.
Texto original
However, further testing in nonhuman primates is required to translate these finding into pathogenic potential in humans. Importantly, the failure of available therapeutics defines a critical need for further study and for the development of treatments. With this knowledge, surveillance programs, diagnostic reagents and effective treatments can be produced that are protective against the emergence of group 2b–specific CoVs, such as SHC014, and these can be applied to other CoV branches that maintain similarly heterogeneous pools.
É possível que até 2019 a criação e o teste de possíveis vacinas de vários coronavírus semelhantes à SARS já estivessem em pleno andamento.

Sobre quantas epidemias milagrosas o espírito da iluminação prepara ...


Bem, então, vamos dar uma olhada na versão de vazamento do laboratório. Para começar, apresentarei um breve histórico sobre outros vazamentos. Porque tiros de vírus de laboratórios no passado aconteceram mais de uma vez. Primeiro, do mesmo SARS-CoV: pela primeira vez ele fugiu no verão de 2003 em Cingapura, depois em dezembro de 2003 em Taiwan e na primavera de 2004 ele voou duas vezes para Pequim.

Houve chamadas alarmantes na Europa e nos EUA, embora não houvesse infecções por lá. Por exemplo, na França, um laboratório de alguma forma perdeu tubos de ensaio com SARS e no laboratório EUA BSL-4 no Texas, faltavam tubos de ensaio com o vírus da febre hemorrágica venezuelana:
Apenas um cientista trabalhou com o vírus, e Reyes disse que o laboratório suspeita que o cientista lançou acidentalmente um tubo de ensaio em novembro.
...
O Biolaboratório Galveston possui as medidas de segurança mais rigorosas porque estuda materiais de biossegurança BSL-4, ou seja, doenças infecciosas perigosas que não possuem vacinas ou medicamentos. Os materiais BSL-4 incluem Guanarito, Ebola e varíola.
Texto original
Only one scientist worked with the virus, and Reyes said the lab suspects that scientist accidentally threw the vial away in November.
…
Galveston biolab requires the most stringent safety measures because it studies biosafetly level BSL-4 materials, or dangerous infectious diseases that have no vaccines or cures. BSL-4 materials include Guanarito, Ebola and smallpox.
A história conhece outros vazamentos em muito maior escala . Por exemplo, a "ressurreição" do vírus da gripe H1N1 em 1977, que antes era considerada desaparecida. Sim, este é o vírus da mesma "mulher espanhola":
H1N1 1918 , ( 1947 ), 1957 «» H2N2, . H1N1, -, , 20 . 1969 H3N2 H2N2 .

1977 . H1N1 , 1978 . , 1977 . H1N1 - , , . , , , H1N1 1977 H1N1, 1949–1950 , , .
…
2009–2010 . , H1N1 1977 : « — A H1N1, 1977 ».
…
, 1977 . H1N1, , « » (Kung 1978). , , , 1970- ( ) . .

, , 1977–78 . - , , -, H1N1 1978 . H1N1, , . 1976–77 20 H1N1 1957, . 1977 , .
Human influenza H1N1 viruses appeared with the 1918 pandemic, and persisted, slowing accumulating small changes in its genome (with a major change in 1947), until the H2N2 “Asian” flu appeared in 1957, causing a worldwide pandemic. H1N1 influenza virus then apparently became extinct, and was not isolated for 20 years. In 1969 the “Hong Kong” H3N2 virus replaced the H2N2 virus, and is still circulating.
In September 1977 an H1N1 influenza virus was isolated from human infections in the Far East region of the Soviet Union, and in early 1978 the Chinese reported they had isolated H1N1 virus in May of 1977 in northeast China adjacent to the Soviet outbreak. Using the early genetic tools available at the time, the 1977 H1N1 virus was found to be closely related to H1N1 human influenza viruses circulating in 1949–1950, but not to those circulating earlier or later.
…
Only since 2009–2010 did major papers begin to state directly the 1977 emergence of H1N1 influenza was a laboratory related release: “The most famous case of a released laboratory strain is the re-emergent H1N1 influenza A virus which was first observed in China in May of 1977 and in Russia shortly thereafter.”
…
The speculation that the 1977 release may have been related to H1N1 vaccine research is supported by the observation that in the initial outbreaks in China, nine of the ten viral isolates expressed “temperature sensitivity” (Kung 1978). Temperature sensitivity normally an uncommon trait, but one that was in the 1970s (and still is) a fundamental trait for making live attenuated influenza vaccines. Temperature sensitivity generally occurs only after a series of substantial laboratory manipulations and selections.
Interestingly, further investigation indicated the circulating strains in 1977–78 were often comprised of mixed temperature-sensitive and normal components, and that temperature sensitivity apparently disappeared from the post-1978 H1N1 lineage rapidly. Escape of a mid-protocol population of H1N1 virus undergoing laboratory selection for temperature sensitive mutants would provide such a mixed population. In 1976–77 laboratory personnel in their late teens or early 20s would not have been exposed to pre-1957 H1N1 influenza viruses, and been susceptible to laboratory infections. The low severity of the 1977 pandemic might be in part due to the temperature sensitivity of the virus, a trait that limits virus replication in pulmonary tissues.
Parece que a criação de mutantes virais sensíveis à temperatura para desenvolver vacinas "atenuadas" em potencial foi disseminada no final do século XX. Se você se lembra, em 1990, Barik também experimentou a criação de cepas sensíveis à temperatura.

Poderia algo assim causar a pandemia de coronavírus de 2019? Por que não? Aqui, várias opções são possíveis - desde o desenvolvimento de uma potencial vacina até a pesquisa sobre recombinação laboratorial dos vírus morcego e pangolim. Algum pesquisador especialmente ambicioso poderia simplesmente decidir por iniciativa pessoal combinar os dois "temas da moda" - adicionar um site de furina e transplantar RBM de uma espécie de uma espécie (pangolin) para outra (morcegos), para que mais tarde confirmasse a crescente virulência do novo design quimérico, lançar outro artigo formidável sobre o perigo que aguarda a humanidade nas cavernas de Yunnan ou nos mercados úmidos. E se uma vacina contra uma cepa tão perigosa pudesse ter sido criada preventivamente, a honra e o respeito por esse pesquisador seriam garantidos.

Eu afirmo que foi assim? Claro que não. Porque hoje não há evidências desse cenário. Há apenas uma série de coincidências estranhas - por exemplo, que o surto do coronavírus de Yunnan ocorreu a milhares de quilômetros de Yunnan, precisamente no mercado mais próximo do Instituto de Virologia de Wuhan. Ou talvez não no mercado, por causa dos quatro primeiros pacientes doentes, três não estavam no mercado . Bem, a coincidência nas características estruturais do genoma do vírus, que se assemelham às manipulações que os virologistas realizaram repetidamente com esses vírus em laboratório. Mas coincidências não são prova.

Além disso, coincidências ocorrem e, é claro, essa tensão também poderia ter surgido na natureza. Ainda não está claro como exatamente - para isso, as cepas de morcego e pangolínio se encontrariam em uma célula (a célula do corpo de alguém, não a de metal), e em Wuhan, desde que o surto ocorreu lá (caso contrário, teríamos visto outros focos da Covid por o caminho do primeiro gado para Wuhan). Dado que os morcegos não foram vendidos no mercado de Wuhan e, em geral, hibernaram nessa época do ano, essa opção ainda é um mistério não resolvido.

A propósito, recentemente houve notícias de que em 2018, especialistas americanos realizaram uma inspeção do Instituto Wuhan por virologistas e até conversaram com Shi Zhengli. O resultado de sua "turnê" foram dois telegramas diplomáticos para Washington, nos quais eles observaram várias fraquezas em garantir a segurança do laboratório:
Fontes do telegrama disseram que deveriam ter despertado o alarme sobre sérios problemas de segurança no laboratório da WIV, especialmente em relação ao trabalho com coronavírus de morcego. Os funcionários da embaixada pediram aos Estados Unidos que prestassem mais atenção neste laboratório e forneçam apoio adicional.
...
« WIV , , », — 19 2018 , , , WIV. ( .)
Pesquisadores chineses da WIV receberam ajuda do Laboratório Nacional Galveston, no Departamento Médico da Universidade do Texas e de outras organizações nos Estados Unidos, mas os chineses buscaram ajuda adicional. Os telegramas argumentam que os Estados Unidos deveriam prestar mais apoio ao laboratório de Wuhan, principalmente porque o estudo dos coronavírus dos morcegos era importante, mas também perigoso.
Texto original
Sources familiar with the cables said they were meant to sound an alarm about the grave safety concerns at the WIV lab, especially regarding its work with bat coronaviruses. The embassy officials were calling for more U.S. attention to this lab and more support for it, to help it fix its problems.
…
“During interactions with scientists at the WIV laboratory, they noted the new lab has a serious shortage of appropriately trained technicians and investigators needed to safely operate this high-containment laboratory,” states the Jan. 19, 2018, cable, which was drafted by two officials from the embassy’s environment, science and health sections who met with the WIV scientists. (The State Department declined to comment on this and other details of the story.)
The Chinese researchers at WIV were receiving assistance from the Galveston National Laboratory at the University of Texas Medical Branch and other U.S. organizations, but the Chinese requested additional help. The cables argued that the United States should give the Wuhan lab further support, mainly because its research on bat coronaviruses was important but also dangerous.
É engraçado que o laboratório do Texas em Galveston, que já havia perdido um tubo de ensaio com o vírus venezuelano , tenha ajudado o povo Wuhan . Além disso, ela ajudou não apenas em palavras, os especialistas de Wuhan fizeram treinamento lá, que foi até redigido pelo Boletim Wuhan (embora agora a publicação tenha sido excluída do site, mas ainda esteja disponível no arquivo da web ):


O toque final no retrato familiar de vazamentos de laboratório: em novembro de 2019, ocorreu um surto de brucelose (infecção bacteriana) em dois centros de pesquisa em Lanzhou , afetando mais de 100 pesquisadores que trabalham lá.

Possíveis vestígios de


Então deixe os virologistas em paz e volte nossos olhos para o próprio vírus. Há algum sinal óbvio de maldade no homem? Primeiro, algumas palavras sobre o que "explícito" significa. É claro que, na natureza, qualquer mutação pode ocorrer completamente por acidente. Mesmo que o vínculo que criou o site furin no CoV2 não fosse "PRRA", mas "MADEINWVHANPRRA", ainda haveria uma chance diferente de zero de que isso pudesse surgir por acaso. Mas, para nós e para qualquer tribunal, acho que isso seria suficiente para provar a origem feita pelo homem além de uma dúvida razoável .

O principal problema dessas evidências é que, mesmo em um vírus criado pelo homem, elas simplesmente podem não existir. Grosso modo, um bom engenheiro genético pode criar um vírus sintético "idêntico ao natural". Além disso, muitas vezes os pesquisadores introduzem deliberadamente mutações sinônimas em suas estruturas, de modo que sua tensão e a natural possam ser distinguidas posteriormente. Mas se o criador do vírus não revelar esses marcadores de masculinidade, é impossível distingui-los das mutações naturais.

Mas, às vezes, traços podem permanecer, principalmente se os criadores não tentarem esconder a maldade humana de seu design. Antes de tudo, estamos falando sobre os locais dos cortes de DNA (lembro-me de que manipulações com vírus RNA são realizadas precisamente em suas construções de DNA), necessário para os criadores costurar diferentes segmentos do genoma ou cortar antigos e inserir novos sites. De fato, o DNA pode ser cortado não em locais arbitrários (Crisper não conta), mas apenas onde a sequência de nucleotídeos (geralmente 4-6 "letras") coincide com a sequência reconhecida por uma ou outra enzima de restrição , ou seja, uma enzima que quebra as cadeias nucleotídicas . Além disso, essa análise complica o fato de que existem centenas de tipos diferentes de enzimas de restrição usadas na engenharia genética. Mas vamos tentar conduzir essa análise para CoV2.

Para começar - um exemplo do trabalho do grupo Barik em 2008, onde eles tomaram o Bat-SCoV e substituíram o RBD em sua proteína spike por RBD da SARS humana. Aqui está como eles descrevem a criação de sua quimera:

SARS-CoV Bat-SCoV.
(A) SARS-CoV Bat-SCoV ( GenBank FJ211859) . () nsp ORF1ab ( , - ; , nsp5 [3C- ]). , , A F. , Bat-SCoV, SARS-CoV, , Bat-SCoV 2 , Bat-E1 Bat-E2, SARS-E.
Schematic representation of SARS-CoV and Bat-SCoV variants.
(A) Schematic representation of SARS-CoV and Bat-SCoV (GenBank accession no. FJ211859) genomes and reverse genetics system. (Top) Arrowheads indicate nsp processing sites within the ORF1ab polyprotein (open arrowheads, papain-like proteinase mediated; filled arrowheads, nsp5 [3C-like proteinase] mediated). Immediately below are the fragments used in the reverse genetics system, labeled A through F. The fragments synthesized to generate Bat-SCoV exactly recapitulate the fragment junctions of SARS-CoV with the exception that the Bat-SCoV has 2 fragments, Bat-E1 and Bat-E2, which correspond to the SARS-E fragment.
Como você pode ver, no início o grupo de Barik criou um clone sintético do bastão Bat-SCoV e, além disso, usando os “padrões” do clone sintético SARS-CoV que eles haviam criado anteriormente. Ou seja, para o clone do morcego, eles usaram os mesmos 6 segmentos com os mesmos sites de enzimas de restrição que eles usavam anteriormente para SARS-CoV, o que lhes permitiu trocar segmentos de vírus entre diferentes cepas como peças de Lego. Aqui está uma descrição detalhada da criação de um mutante quimérico:
, - , SARS-CoV (24, 33, 53) . , Bat-F A-E SARS-CoV F Bat-SCoV, Bgl-NotI. Bat-SCoV Bat-SRBD, Bat-SRBM Bat-Hinge , 7 Bat-SCoV, BglI Bat-A, Bat-B, Bat-C Bat -D, BglI AflII Bat-E1 Bat-E2 BglI NotI Bat-F. , . m7Message mMachine (Ambion), Vero (24, 53).
Viruses containing PCR-generated insertions within the viral coding sequence were produced by using the SARS-CoV assembly strategy (24, 33, 53) with the following modifications. Briefly, for Bat-F virus, full-length cDNA was constructed by ligating restriction products from SARS-CoV fragments A–E and Bat-SCoV fragment F, which required a BglI-NotI digestion. For Bat-SCoV and Bat-SRBD, Bat-SRBM, and Bat-Hinge, plasmids containing the 7 cDNA fragments of the Bat-SCoV genome were digested by using BglI for Bat-A, Bat-B, Bat-C, and Bat-D, BglI and AflII for Bat-E1 and Bat-E2, and BglI and NotI for Bat-F. Digested, gel-purified fragments were simultaneously ligated together. Transcription was driven by using a T7 mMessage mMachine kit (Ambion), and RNA was electroporated into Vero cells (24, 53).
Todas essas abreviações de três letras (BglI, AflII, NotI, etc.) na frase destacada acima são tipos diferentes de enzimas de restrição. Vamos ver se haverá alguma diferença nos locais das enzimas de restrição no genoma (proteína spike) da quimera em comparação com o genoma do SARS-CoV original:


Como pode ser visto, os locais das enzimas de restrição da quimera são quase idênticos aos pedaços das sequências originais em Bat-SCoV ou SARS de onde foram retiradas. As únicas diferenças são visíveis nos locais de reticulação da peça SARS inserida. Aqui, por exemplo, a borda esquerda (5'-) da inserção:


Aqui Bat-SCoV e SARS mostraram ter uma região nucleotídica idêntica comum (a interseção das regiões turquesa e rosa), e não há novos locais de enzimas de restrição no local das duas sequências de costura, pelo contrário, o site SspI da SARS desapareceu. E aqui está a borda direita (3'-) da pastilha:


Aqui, pelo contrário, todos os antigos locais de enzimas de restrição permaneceram no local de ligação, e até os novos apareceram, por exemplo, EcoR II. Se eu não soubesse que o genoma quimérico é o resultado de manipulações feitas pelo homem, eu poderia entender isso observando essas três seqüências? É improvável que, mesmo que algumas suspeitas tenham surgido, certamente não estava além de uma dúvida razoável . Talvez, especialistas em engenharia genética possam ter visto isso por outros sinais, não posso dizer - ficarei feliz com qualquer programa educacional aqui.

Mas, em qualquer caso, vamos comparar a proteína spike em RaTG13, CoV2 e pangolin-19. De repente, algo vai pular sobre nós quando sair!

É assim que o RBD (destacado em verde claro) e o RBM (amarelo) se parecem com os três:


O que é tão interessante? Foi interessante ver o site EcoR I na borda 5 'da RBM para todos os três (a primeira junta entre as áreas verde e amarela) - muito conveniente. Eu me pergunto quão comum é esse recurso em outras linhagens? Uma análise superficial mostrou que nossa trindade é campeã no número de sites no genoma; em outras linhagens de morcegos, existem apenas cinco deles:


Voltando à análise da RBD, a partir das características da CoV2, podem ser observados novos locais de enzimas de restrição destacados em retângulos vermelhos - eles coincidem com mutações únicas na sequência de aminoácidos (também marcadas com retângulos vermelhos nas seqüências de aminoácidos na coluna da direita). Só para garantir, destaquei vários outros sites novos: retângulos azuis e um retângulo verde, que estão localizados na região do único aminoácido que difere entre RBM CoV2 e pangolin-19.

Vamos comparar nas três linhagens o local da inserção do PRRA, que criou o site furin no CoV2:


Aqui também apareceram vários novos sites (destacados em azul) nos dois lados da nova inserção. Eles poderiam ser usados ​​para criar um site furin? Teoricamente, sim. Mas a inserção pode ser feita usando sites existentes, ou mesmo criando segmentos com novos sites, que são combinados sem problemas, ou seja, sem a criação de novos sites na junção. Se você se lembra, Barik em 2002 aplicou essa tecnologia para criar um clone sintético de coronavírus de mouse:
Os locais de junção dos locais de restrição que estão localizados nas extremidades de cada cDNA são sistematicamente removidos durante a montagem do produto completo de cDNA de tamanho completo, o que permite a remontagem sem modificação dos nucleotídeos.
Texto original
The interconnecting restriction site junctions that are located at the ends of each cDNA are systematically removed during the assembly of the complete full-length cDNA product, allowing reassembly without the introduction of nucleotide changes.
E em 2003 ele repetiu no clone sintético SARS-CoV:
Para montar rapidamente clones de consenso, usamos endonucleases de restrição de classe IIS, que são cortadas em regiões assimétricas e deixam extremidades assimétricas. Essas enzimas geram saliências únicas específicas que fornecem ligação perfeita de dois cDNAs com subsequente perda do local de restrição .
Texto original
To rapidly assemble consensus clones, we used class IIS restriction endonucleases that cut at asymmetric sites and leave asymmetric ends. These enzymes generate strand-specific unique overhangs that allow the seamless ligation of two cDNAs with the concomitant loss of the restriction site.
Hoje, a tecnologia de malabarismo com sequências de genes já é tão automatizada e colocada em prática que, em um artigo chinês de outubro de 2019 sobre a inserção de um novo site de furin no coronavírus de frango, há apenas algumas sugestões para sua descrição:
2.2 Criação de um vírus recombinante O vírus
recombinante rYN-S2 / RRKR, contendo uma proteína de espiga com um local de furina S2 ', foi obtido por recombinação de vaccinia, como descrito anteriormente [20, 28]. Resumidamente, um plasmídeo no local S 'furina foi gerado usando o kit Seamless Assembly (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e transfectado para células CV-1 infectadas com vírus vaccinia contendo o gene YN-? S-GPT. O sítio Furin-S2 foi introduzido no cDNA de YN por recombinação homóloga, usando um sistema de seleção dominante temporal [25].
Texto original
2.2. Generation of Recombinant Virus
Recombinant rYN-S2/RRKR virus containing an S protein with the furin-S2? site was generated by vaccinia recombination, as described previously [20,28]. Briefly, plasmid with the furin-S2? site was generated using the Seamless Assembly kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) and transfected into CV-1 cells infected by vaccinia virus containing the genome of YN-?S-GPT. Furin-S2’ site was introduced into the YN cDNA by homologous recombination using the transient dominant selection system [25].
É impossível não admirar a que progresso chegou! Aqui está uma descrição do kit de montagem sem costura acima :
GeneArt 1 4 , , 30- . E.coli .
• — 4 ( 13 ); ,
• — , , , 90% .
• —
• — - -,
• — , , .
The GeneArt Seamless Cloning and Assembly Kit enables the simultaneous and directional cloning of 1 to 4 PCR fragments, consisting of any sequence, into any linearized vector, in a single 30-minute room temperature reaction. The kit contains everything required for the assembly of DNA fragments, and their transformation into E. coli for selection and growth of recombinant vectors.
• Speed and Ease?—?Clone up to 4 DNA fragments, with sequence of your choice, simultaneously in a single vector (up to 13 Kb); no restriction digestion, ligation or recombination sites required
• Precision and Efficiency — Designed to let you clone what you want, where you want, in the orientation you want, and achieve up to 90% correct clones with no extra sequences left behind
• Vector Flexibility — Use our linear vector or a vector of your choice
• Free Tools — Design DNA oligos and more with our free web-based interface that walks you step-by-step through your project
• Diverse Applications — Streamline many synthetic biology and molecular biology techniques through the rapid combination, addition, deletion, or exchange of DNA segments
Até 4 fragmentos de DNA podem ser colados na sequência desejada em apenas meia hora, sem dor de cabeça com enzimas de restrição ou ligação. E faça upload da sua criação para E. coli para propagar o design resultante.

Resumindo a análise dos locais das enzimas de restrição, deve-se reconhecer que não é possível tirar conclusões definitivas de seus resultados. A menos que, mais uma vez, fosse possível garantir que não apenas o CoV2 fosse único, mas o próprio RaTG13 fosse um camarada muito incomum e que vale a pena estudar mais a biografia dele.

Preferências do códon


Para esses propósitos, também decidi dar uma olhada no viés de uso de códons para verificar quais cepas de outros vírus se parecem com CoV2 e RaTG13. Não é segredo que os vírus tendem a se adaptar em suas assinaturas de códons às preferências de seus hosts, então eu esperava ver um padrão semelhante com outros vírus de hepatomírus no RaTG13 e também esperava ver uma diferença em relação às cepas de pangolins.

Aqui, o SARS-CoV, por exemplo, é muito semelhante ao Rs3367 e ao RsSCH014, como você pode esperar:


A propósito, entre si, SARS, MERS e CoV2 diferem:


O RaTG13 é semelhante ao CoV2, o que também é esperado:


Mas o RaTG13 não é realmente muito semelhante às linhagens de pangolins, e as linhagens de pangolins não são exatamente idênticas entre si:


No ZXC21 e ZC45 também não é muito semelhante:


Das cepas de Yunnan, o RaTG13 de Rs3367 e RsSCH014 é bastante distante e mais próximo do LYRa11, mas também com diferenças visíveis:


Em geral, como sempre, RaTG13 e CoV2 são de alguma forma separados. Também fiquei intrigado com o códon AAA - eles o usam muito mais frequentemente do que seus companheiros de tribo:


Provavelmente é apenas mais uma coincidência, mas uma proporção semelhante entre AAA e AAG é observada em E. coli . A assinatura de cDNA do cDNA pode mudar à medida que é cultivada por um longo período em cultura de células? Em teoria, sim, mas ainda não pesquisei profundamente esse assunto.

Bem, a análise de códons também não revelou sinais óbvios de criatividade, mas mais uma vez confirmou a singularidade de CoV2 e RaTG13. O que temos em estado seco? Até agora, apenas um certo conjunto de coincidências estranhas, que, como os cientistas gostam de dizer, tomadas em conjunto , ou seja, no conjunto, fazem você pensar muito. E certamente não permite rejeitar a hipótese sobre a natureza artificial do CoV2.

Mas e a refutação da maldade do homem na natureza?


Como não permite? E por que o autor desse artigo na Nature permite? De fato, não há refutação de maldade neste artigo. Existe apenas um alto "nós não pensamos assim", com base em uma base muito instável. Julgue por si mesmo - estes são os principais pontos dos autores em apoio ao milagroso:
, SARS-CoV-2 ACE2 , , , RBD SARS-CoV [ SARS — ..] . , SARS-CoV-2 ACE2, , ACE2, . , SARS-CoV-2 .
While the analyses above suggest that SARS-CoV-2 may bind human ACE2 with high affinity, computational analyses predict that the interaction is not ideal and that the RBD sequence is different from those shown in SARS-CoV to be optimal for receptor binding. Thus, the high-affinity binding of the SARS-CoV-2 spike protein to human ACE2 is most likely the result of natural selection on a human or human-like ACE2 that permits another optimal binding solution to arise. This is strong evidence that SARS-CoV-2 is not the product of purposeful manipulation.
Esta citação no artigo é mostrada logo abaixo do diagrama, mostrando os RBMs idênticos de CoV2 e pangolin-19. Espere, então o que "simulação de computador" tem a ver com isso? O cenário artificial mais provável é a transferência de RBM de uma cepa de um animal para uma cepa de outro - o que os virologistas já fizeram repetidamente. Portanto, a cadeia lógica de autores não resiste às críticas: “em um computador foi possível projetar um vírus mais acentuado, de modo que o CoV2 é o resultado da seleção natural. Ah, então essa é uma forte evidência de que o CoV2 não é produzido pelas mãos! ” Aparentemente, os autores têm uma lógica ruim. Suas teses adicionais confirmam isso:
, , , , -. , , SARS-CoV-2 - .
Furthermore, if genetic manipulation had been performed, one of the several reverse-genetic systems available for betacoronaviruses would probably have been used. However, the genetic data irrefutably show that SARS-CoV-2 is not derived from any previously used virus backbone.
Novamente, o mesmo erro lógico, velado por voltas altas: "a análise genética prova conclusivamente que o CoV2 definitivamente não foi criado com base em vírus conhecidos anteriormente!" Bem, obrigado, capitão Evidence. E o que, na verdade, os criadores do vírus não conseguiram formar o backbone do cDNA a partir de uma cepa inédita do vírus - por exemplo, do mesmo RaTG13? Sim, fácil. Além disso, eles não teriam dificuldade em inserir o local de RBM pangolínio e furina lá. Os virologistas fazem isso há 20 anos, e as modernas ferramentas de engenharia genética tornam essas manipulações acessíveis até aos estudantes.

Quanto à origem do sítio furin na cultura celular, os autores também expressam teses estranhas:
, O- . in vitro in vivo. , SARS-CoV-2 - , . ACE2, , .
The acquisition of both the polybasic cleavage site and predicted O-linked glycans also argues against culture-based scenarios. New polybasic cleavage sites have been observed only after prolonged passage of low-pathogenicity avian influenza virus in vitro or in vivo. Furthermore, a hypothetical generation of SARS-CoV-2 by cell culture or animal passage would have required prior isolation of a progenitor virus with very high genetic similarity, which has not been described. Subsequent generation of a polybasic cleavage site would have then required repeated passage in cell culture or animals with ACE2 receptors similar to those of humans, but such work has also not previously been described.
Em primeiro lugar, os próprios autores anteriormente fornecem links para trabalhos em que um local de furina surgiu à medida que os vírus eram cultivados nas células. E segundo, o que significa que uma cepa semelhante do vírus não foi descrita - mas e o RaTG13? Se a RBM fosse substituída sinteticamente por pangolínio e, em seguida, a cepa quimérica fosse cultivada em cultura de células, o local da furina poderia muito bem surgir dessa maneira e, além disso, da mesma forma, a nova cepa poderia adquirir outras mutações que distinguem CoV2 de RaTG13 e pangolina-19 .

Mas em termos precisamente da variante artificial da aparência do site furin, provavelmente vejo a opção com uma inserção direcionada - como em outro trabalho chinês de outubro de 2019 com coronavírus de frango. E então a cepa criada pode adquirir novas mutações à medida que é cultivada in vitroou in vivo como uma cepa murina de MA15 em 2007, por exemplo.

Shi Zhengli 2020


Enquanto escrevia este artigo, saiu o trabalho de uma grande equipe de virologistas chineses, incluindo Shi Zhengli, em que, em fevereiro, eles testaram contra o CoV2 seus muitos anos de desenvolvimento a partir de muitos tipos de coronavírus - um peptídeo projetado para bloquear a fusão de uma proteína do tipo espigão com uma membrana celular. Os autores, é claro, mencionam o novo local furin do CoV2 e sugerem que ele pode desempenhar um papel importante na penetração muito mais eficiente do CoV2 na célula:
, SARS-CoV-2 , SARS-CoV, , SARS-CoV-2 .
…
, β- S1/S2, . , SARS-CoV , L . S1/S2 SARS-CoV .
In this study, we have shown that SARS-CoV-2 exhibits much higher capacity of membrane fusion than SARS-CoV, suggesting that the fusion machinery of SARS-CoV-2 is an important target for development of coronavirus fusion inhibitors.
…
Generally, β-B coronaviruses lack the S1/S2 furin-recognition site, and their S proteins are uncleaved in the native state. For example, SARS-CoV enters into the cell mainly via the endosomal membrane fusion pathway where its S protein is cleaved by endosomal cathepsin L and activated. Inducing the S1/S2 furin-recognition site could significantly increase the capacity of SARS-CoV S protein to mediate cellular membrane surface infection.
Nesse contexto, torna-se interessante, mas os autores já realizaram algumas experiências sobre como a adição de novos sítios de furina a vários coronavírus pode influenciar a eficácia de seu peptídeo? Mas não vamos construir suposições desnecessárias, vamos deixar o tempo colocar tudo em seu devido lugar.

A propósito, Barik, aparentemente, decidiu acompanhar Shi Zhengli, e também se juntou à corrida para encontrar fundos do CoV2. Pelo que entendi, ele e seus colegas já tiveram seus dados sobre a eficácia de seu análogo de nucleosídeo (β-D-N4-hidroxicitidina , NHC) contra o SARS-CoV e um MERS, adicionados in vitro aos dados do CoV2 e enviados para impressão. Análogos de nucleosídeos (como o famoso remdesivir) É uma abordagem fundamentalmente diferente da de Shi Zhengli e dos co-autores: aqui, os autores tentam impedir a replicação do vírus deslizando letras "defeituosas" do alfabeto genético, e Shi Zhengli e co-autores tentam impedir que o vírus entre na célula. Teoricamente, essas abordagens podem ser combinadas.

Este é o fim, linda amiga


Ah, espero que até este momento pelo menos alguém leia. Desculpe se eu te aborreci. Ele mesmo em choque: a toca do coelho acabou sendo um reino subterrâneo inteiro. Espero também que tenha sido interessante para você mergulhar no mundo da virologia e considerar de maneira aberta a hipótese da natureza artificial do CoV2. Na minha opinião, o conjunto de dados que citei, em conjunto, não permite rejeitar essa hipótese.

Só para garantir, vou explicar: isso NÃO significa que o CoV2 foi precisamente sintetizado em laboratório. Sim, puramente tecnicamente, não seria difícil para um virologista moderno criar essa tensão. Mas não há evidência direta de que alguém tenha feito isso. E estranhas coincidências ainda não podem servir nem como evidência indireta.

Mas a hipótese inversa sobre a natureza exclusivamente natural do vírus também ainda não é suportada por evidências sólidas. Até o momento, nenhum ancestral intermediário foi encontrado entre RaTG13, pangolin-19 e CoV2, no qual seria possível rastrear a recombinação seletiva que observamos no CoV2, a questão de sua origem permanece em aberto. Talvez ninguém fale melhor do que o próprio Ralph Barik :
Quais animais são portadores zoonóticos de SARS-CoV-2?
Esses animais ainda não foram encontrados. Há evidências de que as pangolinas podem ser um hospedeiro intermediário, mas os vírus da pangolina são apenas 88-98% idênticos ao SARS-CoV-2. Para comparação, as estirpes de coronavírus civet e guaxinim da primeira SARS foram 99,8% idênticas às estirpes de 2003 SARS-CoV. Em outras palavras, estamos falando de várias mutações entre cepas de civeta, guaxinim e humanos em 2003. Os pangolins [cepas de CoV2] têm mais de 3.000 alterações de nucleotídeos, portanto os pangolins não podem ser de modo algum uma espécie de reservatório. Absolutamente sem chance.
Texto original
What is the reservoir species of SARS-CoV-2?
They have not identified the actual reservoir species. Reports show that pangolins are potentially the intermediate host, but pangolin viruses are 88–98% identical to SARS-CoV-2. In comparison, civet and racoon dog strains of SARS coronaviruses were 99.8% identical to SARS-CoV from 2003. In other words, we are talking about a handful of mutations between civet strains, racoon dog strains and human strains in 2003. Pangolin [strains of CoV2] have over 3000 nucleotide changes, no way they are the reservoir species. Absolutely no chance.
Assim vai.

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UPD: cerca de 4% da diferença entre os genomas de RaTG13 e Cov2


Alguns críticos da hipótese laboratorial argumentaram que a diferença genética observada de ~ 4% entre RaTG13 e CoV2 é muito grande para que isso aconteça no laboratório se o RaTG13 for usado como base. As taxas de mutações observadas para vírus de ARN variam amplamente - de 10 -6 a 10 -4 nucleótidos por em vitro a replicação , e em seres humanos, CoV2 aparece para mutar a uma taxa de 25 mutações por ano. Assim, de acordo com a lógica da crítica, levaria anos, se não décadas, para que essas duas linhagens divergissem em 4%. Apesar de ser uma objeção razoável, vejo vários problemas com ela.

Em primeiro lugar, em vitro taxas de mutação são muito mais elevados do quein vivo , pois você pode passar células com muito mais frequência do que infectar novos animais. Como demonstrado por experimentos com SARS e MERS in vitro , mutações significativas podem ser observadas após várias passagens. Por exemplo, em um artigo de 2004, foi relatado que, após 600 passagens, já eram observadas diferenças de 2,1% nas seqüências genômicas das proteínas do tipo espigão entre a cepa original e sua prole:



Além disso, na presença de alguns medicamentos antivirais, por exemplo, os mesmos análogos de nucleosídeos (ribavirina ou remdesivir ), a frequência de mutações nos vírus RNA pode aumentar três vezes:
. 10-4 , -. , 6 . in vitro , , , .
We obtained an estimate of the spontaneous mutation rate of ca. 10-4 substitutions per site or lower, a value within the typically accepted range for RNA viruses. A roughly threefold increase in mutation rate and a significant shift in mutation spectrum were observed in samples from patients undergoing 6 months of interferon plus ribavirin treatment. This result is consistent with the known in vitro mutagenic effect of ribavirin and suggests that the antiviral effect of ribavirin plus interferon treatment is at least partly exerted through lethal mutagenesis.
Assim, se o ancestral do laboratório da CoV2 fosse testado para avaliar como sua mutagênese pode alterar a eficácia de vacinas em potencial ou medicamentos antivirais contra ela, ele poderia rapidamente acumular diferenças significativas.

Mas talvez o maior problema com o argumento da diferença de 4% seja que ela se baseia no fato de que a linhagem RaTG13 é exatamente o que a WIV declarou e que não há outras linhagens mais próximas em sua coleção. Se quisermos considerar abertamente a hipótese de vazamento de laboratório, devemos admitir que não podemos confiar totalmente nos dados do mesmo laboratório suspeito de vazamento. Se o vazamento ocorreu, como sugere a hipótese, a WIV já está tentando ocultá-lo, e os dados que eles fornecem podem muito bem seguir o mesmo objetivo.

, 100%- , . , , , , , , , . — — CoV2 , , , , , . , , , . , , , , .

A propósito, há algo que poderia ajudar a acreditar nas alegações da WIV sobre a natureza do RaTG13 - se eles concordarem em transferir suas amostras de Yunnan de 2013 para laboratórios independentes, dos quais Shi Zhengli extraiu o RaTG13. Eles ainda precisam tê-los se sequenciarem o genoma completo do RaTG13 a partir deles novamente em 2020.

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UPD2: RaTG13 - a mesma cepa que RaBtCoV / 4991?


Depois que publiquei este post, fui indicado a uma pré - impressão afirmando que o RaTG13 pode realmente ser uma cepa de RaBtCoV / 4991 ( KP876546 ), que Shi Zhengli relatou em 2013 em uma mina abandonada de Yunnan em 2016 . Existem várias razões para pensar assim. Primeiro, a única sequência publicada de RaBtCoV / 4991 é 100% idêntica à sequência RaTG13 no nível de nucleotídeo , embora sejam apenas 370 nucleotídeos do gene RdRp:


Em segundo lugar, os dados sobre a coleta de material a partir do qual essas cepas foram isoladas são quase idênticos: ambos foram coletados em julho de 2013 em um swab de morcego de R. affinis :


Uma amostra de RaBtCoV / 4991 foi coletada em uma mina localizada no condado de Mujiang, sob a jurisdição de Puer:
A região autônoma de Mujiang é uma região autônoma sob a jurisdição da cidade de Puer, no sul de Yunnan, na China. Wikipedia
E a cidade de Puer é indicada como o local de reunião do RaTG13 no banco de dados do GISAID, o que pode muito bem ser uma indicação aproximada da localização da mina em Mujiang.

É estranho que, em seu artigo de 2020 sobre RaTG13, Shi Zhengli não mencione RaBtCoV / 4991 e não cite seu artigo de 2016 sobre sua descoberta, na qual é indicado como "desenvolvido e coordenado o estudo". Ao mesmo tempo, é improvável que o RaBtCoV / 4991 seja esquecido completamente, pois é mencionado em um artigo do grupo Shi Zhengli a partir de 2019, onde está incluído na árvore filogenética de outros coronavírus:


Duvido que o lugar de RaBtCoV / 4991 nesta árvore tenha sido determinado apenas com base em um fragmento de 370 nucleotídeos, então acho que, no início de 2019, o grupo Shi Zhengli já havia sequenciado seu genoma.

A propósito, é interessante que os genomas de pangolin-2017 e pangolin-2019 também estejam muito próximos de RaTG13 e CoV2 nesta região do gene RdRp, e CoV2 e pangolin-2019 tenham várias mutações comuns não observadas em RaTG13:

Também decidi comparar o perfil do códon entre RaTG13 e outras linhagens de R. affinis que vivem na mesma mina abandonada. Infelizmente, apenas segmentos de 816 nucleotídeos do gene RdRp ( RaBtCoV / 3750 e RaBtCoV / 4307-2 ) foram publicados para outras cepas de Ra ; portanto, para comparar as preferências de códons, extraí o segmento de 816 nucleotídeos correspondente do RaTG13. Como resultado, o RaTG13 é novamente notavelmente diferente, enquanto as outras duas linhagens são bem próximas:

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