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Cunha por cunha: uso do vírus PIV5 para criar uma vacina contra MERS-CoV e possivelmente contra SARS-CoV-2



Dadas as circunstâncias atuais, não surpreende que a comunidade científica tenha concentrado todas as suas forças na busca e desenvolvimento de métodos e ferramentas para combater o vírus que se espalha. Hoje, olhamos para um estudo em que cientistas da Sociedade Americana de Microbiologia (ASM) descrevem uma vacina muito eficaz contra o vírus MERS, que começou a se espalhar em 2012. Segundo os cientistas, seu desenvolvimento pode ajudar a criar uma vacina contra o SARS-CoV-2 atualmente em fúria. Qual é a peculiaridade da vacina criada, a partir da qual foi criada, e com que eficácia ela realiza sua tarefa? Aprendemos sobre isso com o relatório dos cientistas. Vai.

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A pandemia de COVID-19, uma infecção respiratória aguda potencialmente grave causada pelo coronavírus SARS-CoV-2 (2019-nCoV), foi anunciada oficialmente no mundo. Há muitas informações sobre Habré sobre esse tópico - lembre-se sempre de que pode ser confiável / útil e vice-versa.

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Base de estudo


O MERS ou a síndrome respiratória do Oriente Médio é uma doença inflamatória dos órgãos respiratórios que se desenvolve devido à infecção pelo vírus do gênero Betacoronavirus da subfamília agora conhecida Coronavirinae.


Instantâneo de MERS-CoV (amarelo).

A fonte do vírus MERS-CoV é novamente morcegos. Os primeiros casos de infecção entre pessoas foram registrados em 2012 no território da Península Arábica, mas em 2015 o vírus chegou aos países do leste da Ásia e da Europa. Segundo os dados mais recentes, o número de casos confirmados de infecção por MERS-CoV é de 2494 pessoas, das quais 858 morreram (dados de 02.02.2020). Os dados variam de fonte para fonte, mas é claramente visto que o grau de distribuição no MERS-CoV não é tão grande quanto no SARS-CoV-2. No entanto, o vírus do Oriente Médio também tem uma taxa de mortalidade bastante alta - cerca de 35%. Este indicador é o mais preocupante.

MERS-CoV é um vírus de RNA de cadeia positiva * , no qual a penetração nas células-alvo é realizada devido à proteína Senvelope viral * .
Vírus de RNA de cadeia positiva * - RNA viral positivo. Isto implica que uma sequência de RNA viral específica pode ser traduzida diretamente em proteínas virais (por exemplo, proteínas necessárias para a replicação do vírus). Portanto, em vírus de RNA com uma cadeia positiva, o gene do RNA viral pode ser considerado um mRNA viral (RNA mensageiro) e pode ser imediatamente traduzido pela célula hospedeira.
Envelope viral * - um envelope adicional que cobre o envelope externo (capsídeo) de muitos vírus.
A proteína S consiste na subunidade S1 responsável pela ligação ao receptor do vírus, dipeptidil peptidase 4 (DPP4 ou CD26) através do domínio de ligação ao receptor (RBD do domínio de ligação ao receptor ), bem como na subunidade S2, que fornece fusão de membrana.

Os pesquisadores lembram que, no momento, não há vacina contra o MERS-CoV, existem apenas alguns desenvolvimentos cuja eficácia é bastante duvidosa. Os cientistas acreditam que seu trabalho mudará essa situação.

Neste estudo, os cientistas decidiram voltar a atenção para outro vírus - o PIV5. Os vírus PIV ou parainfluenza (PG) têm cinco variedades, três das quais causam doenças em seres humanos (de PG-1 a PG-3) e duas que não são perigosas para os seres humanos (PG-4 e PG-5).


Instantâneo TEM do vírus parainfluenza.

PG-5 é um membro do gênero Rubulavirus da família Paramyxoviridae, que inclui o vírus da caxumba (MuV ou “caxumba”) e o vírus da parainfluenza humana tipo 2 (PG-2) e tipo 4 (PG-4). PG-5 codifica oito proteínas virais conhecidas. A proteína nucleocapsídeo (NP), a fosfoproteína (P) e a proteína RNA polimerase (L) são importantes para a transcrição * e replicação * do genoma do RNA viral.
Transcrição * - o processo de síntese de RNA usando o DNA como modelo; transferência de informação genética do DNA para o RNA.
Replicação * é o processo de criação de duas moléculas de DNA filha baseadas no DNA dos pais.
Os cientistas acreditam que o PG-5 é um excelente candidato para vetores virais * para a futura vacina. O PG-5 é bastante seguro, apesar de seu alto grau de infecciosidade, que pode afetar as mãos ao criar uma vacina eficaz.
Os vetores virais * são ferramentas para fornecer material genético às células alvo.
Além disso, o PG-5 não possui uma fase de DNA em seu ciclo de vida, o que evita possíveis modificações genéticas inadvertidas do DNA da célula hospedeira por recombinação ou inserção. Além disso, a estrutura do PG-5 é bastante estável, em contraste com os vírus de RNA com uma cadeia positiva. Isso é confirmado pelo PG-5 recombinante criado que expressa o gene F para o vírus sincicial respiratório, quando o gene F foi mantido por mais de 10 gerações.

Outra vantagem do PG-5 é sua relação custo-benefício, pois esse vírus pode crescer até 8x10 8 PFU / ml (PFU - unidades formadoras de placas).

Anteriormente, o PG-5 já era usado como vetor viral ao trabalhar com vacinas contra o vírus sincicial respiratório e a raiva. Durante experimentos em camundongos, verificou-se que o vetor PG-5 que expressa a NA (neuraminidase, que faz parte da membrana) do vírus influenza leva à completa imunização dos sujeitos experimentais, ou seja, 4 dias após a infecção, não houve um único caso de morte ou mesmo infecção. Mas o PG-5, expressando NP (nucleoproteína), protege 100% dos camundongos experimentais da cepa letal do vírus da influenza H1N1.

Com base em resultados tão positivos de estudos anteriores, os cientistas decidiram usar o PG-5 como um vetor viral que expressa a proteína S do vírus MERS. Como antes, todas as experiências foram realizadas em ratos.

Resultados da pesquisa


Os pesquisadores introduziram preliminarmente o gene HA (hemaglutinina) do vírus influenza A em diferentes locais do genoma PG-5 e descobriram que inserções em SH (pequena hidrofóbica) e HN (hemaglutinina-neuraminidase) proporcionam uma melhor resposta imune.
O vírus da influenza, hemaglutinina e neuraminidase *, são os antígenos de superfície do vírus, proporcionando a capacidade de ligação às células-alvo.
Diante disso, decidiu-se introduzir o gene S em tamanho real do vírus MERS na interseção de SH e HN. Um plasmídeo * contendo um cDNA * PG-5 de tamanho completo com um gene S inserido na junção de SH e HN foi construído usando métodos padrão de clonagem molecular ( 1A ).


Imagem Nº 1
O plasmídeo * é uma pequena molécula de DNA separada dos cromossomos e capaz de replicação independente.
cDNA * - DNA complementar, isto é, DNA sintetizado em uma matriz de mRNA maduro (RNA mensageiro) em uma reação catalisada pela transcriptase reversa.
O plasmídeo foi transfectado * em células BHK * juntamente com plasmídeos que expressam a RNA polimerase TG, NP, P e L do vírus PG-5 (PIV5).
Transfecção * - a introdução de ácido nucleico nas células por um método não viral.
As células BHK * ( rim de bebê-hamster ) são células do tecido conjuntivo (fibroblasto) dos rins de hamster, sensíveis a muitos vírus que afetam os seres humanos. As células BHK são usadas para transformação, bem como para transfecções estáveis ​​e transitórias.
O resultado foi o vírus infeccioso PIV5-MERS-S, que foi posteriormente purificado e multiplicado em grande número nas células MDBK * para análises posteriores.
Células MDBK * ( células renais caninas Madin-Darby ) - células renais de cães, isoladas pela primeira vez em 1958 pelos cientistas SH Madin e NB Darby. Essas células são usadas em pesquisas como células modelo de mamífero.
O genoma do vírus foi sequenciado e confirmou que contém a sequência de DNA de entrada desejada. Em seguida, foi necessário verificar a expressão da proteína S em células infectadas com PIV5-MERS-S. Para isso, as células foram infectadas com diferentes valores de MOI * , após o que foram lisadas (dissolvidas) para imunotransferência * usando um anticorpo anti-S.
MOI * ( multiplicidade de infecção ) - a multiplicidade de infecção, ou seja, a proporção de agentes (vírus) para alvos de infecção (células).
A imunotransferência * é um método altamente sensível para detectar proteínas, com base em uma combinação de eletroforese e imunoensaio enzimático ou análise radioimune.
A análise mostrou a presença de proteína S completa e fragmentos S2, o que indica o sucesso de sua implementação ( 1B ). A expressão da proteína S em células infectadas com PIV5-MERS-S foi ainda confirmada por análise de imunofluorescência ( 1C ).

Os cientistas observam que o PIV5-MERS-S causou formação maciça de sincício * nas células Vero * . Além disso, a cinética de crescimento de PIV5-MERS-S e PG-5 convencional (PIV5) foi muito semelhante ( 1D ).
Syncytium * é um tipo de tecido no qual as células não são completamente separadas, ou seja, existem seções do citoplasma com núcleos interconectados por plasmodesmata (pontes citoplasmáticas).
Vero* — , .


Imagem Nº 2

Imunização O PIV5-MERS-S gera anticorpos neutralizantes e imunidade mediada por células T. Para determinar se o PIV5-MERS-S pode gerar respostas imunes, os camundongos foram imunizados com uma dose única de PIV5-MERS-S ou com o vírus PIV5-GFP de controle a 10 4 PFU ou 10 6 PFU por indivíduo por via intranasal.

Enquanto ambas as doses provocaram respostas de anticorpos, os títulos neutralizantes foram modestos a 1:64 e 1: 128 para 10 4 e 10 6 doses, respectivamente ( 2A e 2B ).

Os cientistas lembram que camundongos das espécies C57BL / 6 e BALB / c após a imunização geram respostas imunes dominantes em Th1- e Th2, respectivamente.
Th (auxiliares T) - linfócitos T que melhoram a resposta imune adaptativa (imunidade adquirida).

Th1 - promove o desenvolvimento de uma resposta imune celular ativando macrófagos.

Th2 - ativa os linfócitos B, que ajudam no desenvolvimento de uma resposta imune humoral.
Uma dose de PIV5-MERS-S (10 6 PFU) resultou em um título de anticorpos neutralizantes até 1: 2000 em camundongos BALB / c ( 2C ), o que é consistente com a resposta dominante em Th2 em camundongos desta espécie.

Para avaliar a resposta primária de células T CD8 * geradas por imunização com PIV5-MERS-S, os camundongos hDPP4-KI foram imunizados por via intranasal com PIV5-MERS-S (10 4 PFU).
CD8* ( 8) — , - .
Quatro semanas depois, uma cerca foi tomada para examinar a presença / ausência de células T CD8 residentes pulmonares específicas para MERS-CoV ( 3A ).


Imagem No. 3

Como mostrado em 3B - 3D , houve um aumento significativo na porcentagem e no número total de células CD8-IFN nos pulmões de camundongos imunizados com PIV5-MERS em comparação com aqueles infectados com PIV5-GFP.

Para avaliar a resposta das células T CD8 específicas de MERS-S, uma injeção adicional de MERS-CoV MA foi realizada (10 4 PFU). Como resultado, foi observado um aumento significativo na resposta das células T CD8 no quarto dia em comparação aos camundongos infectados com o controle PIV5-GFP ( 3E - 3G)

Também foi observado um aumento de 10 vezes nas células T CD8 específicas de MERS-S em comparação com a resposta primária das células T CD8 ( 3B - 3G ).


Imagem No. 4

Como resultado da imunização com PIV5-MERS-S, evita-se a morte da infecção em camundongos. Para determinar a eficácia do PIV5-MERS-S na prevenção ou modificação do vírus MERS-CoV, os camundongos hDPP4 KI foram imunizados com o PIV5-MERS-S (10 4 PFU) pela via intranasal.

4 semanas após a imunização, os camundongos foram infectados com MERS-S modificado para serem mais ativos em camundongos ( 4A ). Todos os camundongos imunizados com PIV5-MERS-S sobreviveram a esta infecção mortal, com leve perda de peso ( 4B e4C ). Por outro lado, todos os camundongos infectados com o controle PIV5-GFP ou PBS morreram após a infecção. Isso indica que o PIV5-MERS-S protegeu totalmente os ratos da infecção letal.

Apesar do fato de os camundongos imunizados com PIV5-MERS-S apresentarem uma maior taxa de depuração pulmonar do vírus, esse método não forneceu imunidade esterilizante completa ( 4D ).


Imagem nº 5 Os

estudos histopatológicos dos pulmões após a infecção mostraram que camundongos imunizados com PIV5-MERS-S tinham significativamente menos detritos celulares * e mais infiltrados mononucleares ( 5A e 5B ).
Detritos celulares * é o restante da célula cercada por uma membrana plasmática que é fagocitada por macrófagos.
Forte infiltração de leucócitos (principalmente células mononucleares) e menos danos (edema, membranas hialinas, restos de células necróticas, etc.) também foram detectados.

Na fase final do estudo, os cientistas avaliaram as respostas protetoras induzidas por PIV5-MERS-S ou MERS-CoV inativado. Para isso, alguns camundongos foram imunizados com PIV5-MERS-S (10 4 PFU) ou PBS, enquanto outros foram imunizados com MERS-CoV inativado por UV.

Enquanto o PIV5-MERS-S forneceu 100% de proteção contra infecções letais, o MERS-CoV inativado protegeu apenas 25% dos camundongos (imagem abaixo).


Imagem nº 6

Em seguida, foi realizado um estudo sobre os pulmões de camundongos que foram imunizados e depois infectados com MERS-CoV (imagem abaixo).


Imagem Nº 7

Foram observados mais eosinófilos (um tipo de glóbulo branco) nos pulmões em camundongos imunizados com MERS-CoV inativado do que em camundongos imunizados com PBS ou PIV5-MERS-S após infecção por MERSCoV.

Comparado ao PBS, a infiltração eosinofílica perivascular aumentou significativamente no grupo MERS-CoV inativado, mas nenhuma diferença estatística foi observada em comparação ao grupo imunizado com PIV5-MERS-S.

Também foi feita uma avaliação da formação de uma membrana hialina nos alvéolos dos pulmões, que é um sinal claro de doença pulmonar grave. Comparados ao grupo PBS, camundongos imunizados com PIV5-MERS-S mostraram proteção significativa contra a formação de membrana hialina. Mas os camundongos imunizados com MERS-CoV inativado mostraram apenas uma ligeira diminuição na formação da membrana hialina, o que indica a baixa eficiência desse método de imunização em comparação com o PIV5-MERS-S.

Para um conhecimento mais detalhado das nuances do estudo, recomendo que você analise o relatório dos cientistas .

Epílogo


Neste trabalho, os cientistas conseguiram demonstrar um método bem-sucedido de imunizar ratos com o vírus MERS-CoV, que anda livremente em nosso planeta desde 2012.

A principal característica distintiva do método desenvolvido é o uso de outro vírus, chamado PG-5, como vetor viral. Em outras palavras, a cunha é expulsa por cunha.

O uso do vírus como transporte para a entrega de genes necessários à imunização pode ser considerado um método bastante incomum, mas pode contribuir para uma luta mais eficaz contra vírus. Os próprios pesquisadores dizem que seu trabalho visa não apenas combater o MERS-CoV, mas também o SARS-CoV-2 (COVID-19). Ambos os vírus pertencem à mesma subfamília, têm vias de infecção semelhantes e efeitos nas células-alvo. Se o método de imunização desenvolvido for mais desenvolvido, pode ser possível criar uma vacina suficientemente eficaz.

É isso que os autores deste trabalho planejam fazer no futuro. Se eles conseguem criar uma super vacina ou não, o tempo dirá. No entanto, agora eles são dignos de todos os elogios, pelo menos por prestarem atenção ao vírus, do qual todos pareciam esquecer.

Seja como for, só podemos esperar que a ciência e todos os envolvidos, como muitas vezes antes, sejam capazes de superar todos os preconceitos e medos, superar todos os obstáculos e mostrar que o pensamento analítico, baseado no conhecimento e na lógica, é sempre capaz de encontre uma saída para qualquer situação atual, por mais terrível que seja à primeira vista.

Obrigado pela atenção, continuem curiosos e tenham uma boa semana de trabalho, pessoal.

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