Eles dizem que a vida é um processo contínuo de envelhecimento, que inevitavelmente termina na morte. Isso pode não parecer muito otimista, mas essas são as leis da natureza. O envelhecimento e a morte são alguns dos reguladores mais importantes de uma população de qualquer tipo no planeta, e a imortalidade no sentido biológico da palavra existe apenas em livros e filmes. A mesma situação ocorre com a juventude "eterna". Nos livros, temos Dorian Gray - um jovem eternamente jovem e bonito, com uma forte antipatia por uma obra de arte específica; Edward Cullen é um vampiro eternamente jovem com deficiência de vitamina D e alta refletividade da pele, etc. Na realidade, a juventude eterna ou pelo menos prolongada é inatingível. Pelo menos se os cientistas não interferirem no processo. Hoje vamos conhecer o estudo,em que cientistas da Universidade de Stanford conseguiram rejuvenescer células humanas antigas devido a certas proteínas envolvidas no processo de desenvolvimento embrionário. Quais substâncias foram usadas, qual a idade das células e quanto tempo durou o efeito? Aprendemos sobre isso no relatório do grupo de pesquisa. Vai.Base de estudo
O que é o envelhecimento? Na sua essência, esse é um processo de perda gradual de funcionalidade no nível de moléculas, células, tecidos e todo o organismo.No nível da cromatina * , o envelhecimento está associado a um acúmulo progressivo de erros epigenéticos * , que acabam levando à regulação gênica aberrante (anormal), depleção de células-tronco, envelhecimento e homeostase celular / tecidual prejudicada.Cromatina * - a base dos cromossomos, composta por DNA e proteínas (principalmente histonas). A cromatina está localizada dentro do núcleo das células eucarióticas (organismos que têm um núcleo nas células) e faz parte do nucleoide dos procariontes (unicelulares sem núcleo).
Herança epigenética * - um conjunto de alterações herdadas no fenótipo ou na expressão gênica.
Se você aplicar a reprogramação nuclear de células de pluripotência * , poderá revertê-la conforme a idade, mas não a identidade.A pluripotência * é uma característica de uma célula que pode se diferenciar em todos os tipos de células, exceto nas células de órgãos extra-germinativos.
Anteriormente, essa técnica já havia sido testada em ratos. Os resultados foram muito encorajadores, pois a reprogramação temporária melhorou as características da idade e prolongou a vida útil dos ratos. Mas o homem não é um rato e, portanto, permanece a questão de como essa técnica funcionará nas células humanas. É exatamente isso que os cientistas estão considerando neste estudo.O processo de reprogramação nuclear em células-tronco pluripotentes induzidas ( iPSCs * ) é caracterizado por uma redefinição completa (redefinição) das características epigenéticas das células, o que leva ao retorno da identidade celular e da idade a um estado semelhante ao embrião.As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) * são um tipo de células-tronco obtidas em laboratório a partir de células diferenciadas maduras de um organismo de mamífero (incluindo seres humanos).
É curioso que a reprogramação não seja irreversível, parando no chamado ponto sem retorno (PNR do ponto sem retorno), após o qual as células retornam ao seu estado somático original * .Célula somática * - células que compõem o soma (corpo do corpo), mas não envolvidas no desenvolvimento sexual.
Portanto, se a reprogramação afetará a célula por um período bastante curto, a expressão de fatores de reprogramação não poderá apagar a assinatura epigenética que determina a identidade das células. Acontece que uma exposição curta não muda a identidade da célula, mas pode afetar sua idade?A primeira evidência de que a reprogramação temporária pode melhorar os fenótipos durante o envelhecimento foi demonstrada em camundongos. Mas, como os cientistas já nos lembraram, os ratos não são humanos. Uma questão importante dessa técnica é se ela pode funcionar em células humanas de ocorrência natural isoladas de pessoas mais velhas.Para descobrir, os cientistas realizaram uma série de experimentos para identificar o grau de impacto da reprogramação nuclear nos fenótipos (sinais externos e internos) das células humanas e camundongas.Resultados da pesquisa
Primeiro, foi feita uma avaliação do efeito da expressão transitória de fatores de reprogramação na transcrição de dois tipos diferentes de células ( fibroblastos * e células endoteliais * ) em idosos. Em seguida, a transcrição dos idosos foi comparada com a transcrição dos mesmos tipos celulares de doadores jovens ( 1a e 1e ).Fibroblasto * - células do tecido conjuntivo do corpo que sintetizam a matriz extracelular.
Endotélio * - uma camada de células planas nas paredes internas dos vasos sanguíneos, vasos linfáticos e cavidades cardíacas.
Imagem nº 1Os fibroblastos foram obtidos a partir de amostras de biópsia * da pele das mãos e abdômen dos participantes do estudo: 3 pessoas com idades entre 25 e 35 anos (grupo jovem) e 8 pessoas com idade entre 60 e 90 anos (grupo idoso).Biópsia * - material biológico obtido por biópsia.
As células endoteliais foram extraídas da veia e artéria ilíaca dos participantes do estudo: 3 pessoas com idade entre 15 e 25 anos (grupo jovem) e 8 pessoas com idade entre 50 e 65 anos (grupo idoso).Para as experiências, foi utilizado um protocolo de reprogramação não integrativa, que foi otimizado com base em um conjunto de mRNAs que expressam as proteínas OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC, LIN28 e NANOG.Esse protocolo produz sequencialmente colônias de iPSC, independentemente da idade dos doadores, após 12 a 15 transfecções diárias * .A transfecção * é o processo de introdução de ácido nucleico nas células eucarióticas pelo método não viral.
Verificou-se que o ponto de não retorno neste caso é observado no quinto dia de reprogramação. Esta conclusão é baseada no fato de que a primeira expressão detectável do dcRNA * associado à pluripotência endógena ocorre no dia 58.Os dnaRNAs (RNAs não codificadores longos) * são moléculas de RNA localizadas no núcleo ou no citoplasma que não são traduzidas em proteínas.
Em vista disso, decidiu-se usar um regime temporário de expressão exógena no qual a OSKMLN foi transfectada diariamente por 4 dias consecutivos, e a análise da expressão gênica foi realizada 2 dias após a interrupção ( 1b ).Em seguida, o sequenciamento de RNA em massa pareado foi realizado para ambos os tipos de células dos três grupos de indivíduos: jovens (Y), idosos sem reprogramação (UA) e idosos com reprogramação (TA).Para começar, os cientistas compararam os transcritos quantificados e normalizados de indivíduos jovens e idosos sem reprogramação (Y e UA). A análise mostrou que 961 genes (5,85%) em fibroblastos ( 1a e 1c ) e 748 genes (4,80%) em células endoteliais ( 1e e 1f) diferiam entre células jovens e velhas.Esses conjuntos de genes estão diretamente relacionados aos processos de envelhecimento. A determinação da direção da expressão acima ou abaixo do valor médio de cada gene mostrou uma clara semelhança entre as células de jovens e as de idosos após reprogramação para fibroblastos e células endoteliais ( 1d e 1g ).Usando o método descrito acima, os cientistas compararam populações de células de indivíduos idosos com e sem reprogramação (TA e UA; 1a e 1e ). Verificou-se que 1042 genes em fibroblastos e 992 em células endoteliais foram expressos diferencialmente.Estes perfis de transcriptoma foram então utilizados para confirmar a preservação da identidade celular após reprogramação. A análise mostrou que não houve mudanças significativas na identidade.Em geral, a análise de assinaturas de transcriptoma mostrou que a expressão de OSKLMN promove uma ativação muito rápida de um perfil de expressão gênica mais jovem, sem afetar a expressão gênica da identidade celular.Os pesquisadores observam que os relógios epigenéticos * baseados nos níveis de metilação do DNA * são os biomarcadores moleculares mais precisos da idade em tecidos e células. Eles também são preditivos de muitas condições relacionadas à idade, incluindo expectativa de vida.* — , , .
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Sabe-se também que a expressão exógena de fatores de reprogramação canônica (OSKM) retorna a idade epigenética das células primárias ao estado pré-natal.Para testar se a expressão transitória de OSKMLN pode reverter os relógios epigenéticos das células somáticas humanas, os cientistas usaram dois tipos de relógios epigenéticos que se aplicam a fibroblastos e células endoteliais humanas: o relógio epigenético original de Panvis Horvath (baseado em 353 pares de citosina-fosfato-guanina) e, posteriormente, relógios "pele-sangue" (baseados em 391 CpGs - locais das moléculas de DNA).Calculadora da idade epigenética de HowarthDe acordo com o relógio epigenético de Howart, a exposição temporária ao OSKMLN reverteu significativamente a idade da metilação do DNA (diferença média de idade = -3,40 anos). O efeito do rejuvenescimento foi mais pronunciado nas células endoteliais (diferença média de idade = -4,94 anos; 1i ) do que nos fibroblastos (diferença média de idade = -1,84; 1 h ).Resultados qualitativamente semelhantes, mas menos significativos foram obtidos usando um relógio pele-sangue: o efeito geral do rejuvenescimento é de -1,35 anos; o rejuvenescimento médio nas células endoteliais é -1,62 e nos fibroblastos -1,07.Com base nesses resultados, foi feita uma análise do efeito da reprogramação temporária em vários sinais do envelhecimento fisiológico celular. Para isso, foi realizada a visualização de células individuais e um extenso banco de dados de sinais de envelhecimento.
Imagem No. 2Todas as análises foram realizadas separadamente em cada linhagem celular separada ( 2a ): 19 linhas de fibroblastos (3 - jovens, 8 - idosos e 8 - idosos após reprogramação) e 17 linhas de células endoteliais (3 - jovens, 7 - idosos e 7 - idosos após reprogramação). A análise estatística foi realizada por amostragem aleatória de 100 células por amostra.Para expandir os resultados anteriores em epigenética, medições quantitativas adicionais foram realizadas usando imunofluorescência (IF) do rótulo repressivo epigenético H3K9me3, proteína HP1γ associada à heterocromatina e proteína LAP2α que suportam a laminina nuclear * ( 2b - 2d ).Lamin Nuclear * - uma rede rígida fibrilar sob a membrana nuclear, que está envolvida na organização da cromatina.
Como relatado anteriormente em estudos anteriores, em fibroblastos maduros e células endoteliais, foi observada uma diminuição no sinal nuclear para todos os três marcadores em comparação com células jovens. A reprogramação de células mais antigas levou a um aumento desses marcadores nos dois tipos de células.Em seguida, a atividade proteolítica (hidrólise de proteínas) das células foi estudada medindo a formação de autofagossomos, e a atividade do proteassoma semelhante à quimiotripsina. A reprogramação não apenas aumentou os dois tipos de atividade para o nível de células jovens, mas também a excedeu ( 2e e 2f ). Isso sugere que os estágios iniciais da reprogramação contribuem para a depuração ativa de biomoléculas degradadas.Um dos sinais mais indicativos do envelhecimento celular é a diminuição da atividade mitocondrial, o acúmulo de espécies reativas de oxigênio (ERO) e a desregulação da sensibilidade dos nutrientes. Portanto, é possível verificar o efeito da reprogramação no envelhecimento das células, medindo o potencial de membrana das mitocôndrias, mitocôndrias ROS e níveis de proteína de Sirtuin1 (SIRT1).A reprogramação temporária aumentou o potencial de membrana das mitocôndrias nos dois tipos de células ( 2g ), diminuiu a ERO mitocondrial ( 2h ) e aumentou os níveis de proteína SIRT1 nos fibroblastos, o que é observado em células jovens.A imagem celular através da coloração de beta-galactosidase associada ao envelhecimento mostrou uma diminuição significativa no número de células envelhecidas nas células endoteliais, mas não nos fibroblastos. Isso foi acompanhado por uma diminuição na quantidade de citocinas fenotípicas secretórias associadas ao envelhecimento pró-inflamatório e novamente nas células endoteliais, mas não nos fibroblastos ( 2i ).Também foi descoberto que em nenhum dos tipos de células o comprimento do telômero * mostra alongamento significativo após a reprogramação. Isso pode indicar que as células não se diferenciam em um estado semelhante às células-tronco quando a atividade da telomerase * é reativada.* — .
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Verificou-se também que os efeitos da reprogramação nas células persistiram mesmo após 4 e 6 dias após a interrupção desse processo. Do ponto de vista da velocidade de manifestação dos efeitos da reprogramação, eles já eram observados 2 dias após o início desse processo.No total, esses dados sugerem que a expressão transitória de OSKMLN pode causar melhoria rápida e contínua e alteração na idade celular em células somáticas humanas nos níveis transcriptoma, epigenético e celular. Além disso, esse rejuvenescimento ocorre nos estágios iniciais da reprogramação, devido aos quais essa técnica não tem tempo para afetar a identidade das células.Os cientistas decidiram então descobrir se a expressão transitória do OSKMNL também poderia reverter os fenótipos inflamatórios associados ao envelhecimento. Após obter evidências preliminares dessa alteração nas células endoteliais ( 2j ), a análise foi ampliada com a adição de osteoartrite, uma doença fortemente associada ao envelhecimento e caracterizada por um processo inflamatório pronunciado que afeta os condrócitos nas articulações.Foram coletadas amostras - condrócitos da cartilagem de seis pacientes com idades entre 60 e 70 anos que foram submetidos a uma operação de substituição articular completa devido a osteoartrite em estágio tardio. Além disso, essas amostras foram submetidas a reprogramação e os resultados foram comparados com os dados de condrócitos de três jovens ( 3a ).
Imagem No. 3A expressão temporária de OSKMLN foi realizada por 2 ou 3 dias, e a análise foi realizada 2 dias após a interrupção da reprogramação, embora os pacientes tenham tido um efeito mais duradouro com tratamento mais prolongado.No entanto, o uso de OSKMLN mostrou uma diminuição significativa nos níveis de mRNA intracelular de RANKL (citocina da família de fatores de necrose tumoral) e iNOS2, bem como níveis de fatores inflamatórios secretados pelas células ( 3b - 3d ).Além disso, foram observados um aumento na proliferação celular ( 3e ), um aumento na produção de ATP ( 3f ) e uma diminuição no processo oxidativo ( 3g e 3h ).A verificação da identidade celular mostrou que o processo de reprogramação não a violou: não houve efeito no nível de expressão de SOX9, e o nível de expressão de COL2A1 aumentou significativamente (qRT-PCR em 3i e 3j ).A partir dos resultados acima, conclui-se que a expressão transitória de OSKMLN pode contribuir para uma reversão parcial da expressão gênica e da fisiologia celular em condrócitos mais antigos com osteoartrite para um estado mais jovem. Portanto, a técnica estudada também pode ser utilizada como um dos métodos de tratamento da osteoartrite em idosos.Outro sinal importante do envelhecimento é a perda da função das células-tronco e a perda da capacidade regenerativa. Para testar o efeito da reprogramação sobre esses fatores, os cientistas usaram células-tronco do músculo esquelético do rato (MuSC).Os MuSCs foram expostos à reprogramação por 2 dias enquanto estavam em repouso. Indivíduos com idade entre 3 meses e 20 a 24 meses ( 4a ) serviram como doadores da amostra .
Imagem No. 4 Oprocessamento do MuSC antigo diminuiu o tempo da primeira divisão, aproximando-o da cinética mais rápida de ativação das células MuSC jovens e da massa mitocondrial. Além disso, a reprogramação restaurou parcialmente a capacidade reduzida de MuSCs individuais para formar colônias.Em seguida, foi realizado um teste da funcionalidade e eficácia do MuSC em relação à regeneração de novos tecidos. Para isso, a transdução de células MuSC jovens, idosos ou temporariamente reprogramadas foi realizada usando luciferase e GFP que expressam lentivírus, que foram transplantadas em músculos lesados da tíbia anterior de camundongos imunocomprometidos.A imagem bioluminescente mostrou inicialmente que os músculos nos quais os MuSCs reprogramados foram colocados apresentaram o sinal mais alto (dia 4; 4b e 4c ). No entanto, no dia 11, esses músculos tornaram-se semelhantes aos músculos onde os MuSCs jovens foram adicionados. Mas os músculos onde as células MuSC envelhecidas foram adicionadas sem reprogramação mostraram os sinais mais fracos ( 4b e 4c)A análise de imunofluorescência mostrou que as células com reprogramação forneceram aos tecidos mais miofibrilas do que as células sem tratamento ( 4d e 4e ). 60 dias após a primeira análise, foi realizada outra que apresentou os mesmos resultados ( 4g ). Isso indica diretamente uma melhora na capacidade regenerativa dos tecidos após a exposição a células que passaram por reprogramação.Na fase seguinte do estudo, foi dada atenção especial às alterações musculares degenerativas atróficas relacionadas à idade. Os cientistas decidiram verificar se sua técnica pode restaurar a força muscular de camundongos idosos ao nível dos jovens.Primeiro, a força tetânica * foi estabelecida nos músculos de camundongos com idades entre 4 e 27 meses.Tétano * - uma condição de contração muscular prolongada.
Como esperado, em camundongos mais velhos, essa força foi significativamente menor que em camundongos jovens, o que indica um fator de idade ( 4h ).Em seguida, as células MuSC foram isoladas de camundongos com idades entre 20 e 24 meses, que posteriormente foram submetidos a um processo de reprogramação, e depois transplantadas para o músculo danificado por cardiotoxina de camundongos com 20 meses. Após 30 dias, as medidas de força tetânica foram repetidas.Os músculos nos quais as células foram transplantadas sem reprogramação apresentaram os mesmos resultados que os músculos normais de camundongos idosos sem nenhuma intervenção. Mas os músculos onde as células com reprogramação foram colocadas mostraram forças tetânicas comparáveis aos músculos de ratos jovens ( 4h ).Conclui-se que a reprogramação temporária em combinação com a terapia baseada em MuSC pode restaurar a função fisiológica dos músculos envelhecidos para as funções dos músculos jovens.A realização de um procedimento semelhante com músculos e células humanas mostrou resultados positivos semelhantes ( 4i e 4j ).Para um conhecimento mais detalhado das nuances do estudo, recomendo que você analise o relatório dos cientistas e materiais adicionais .Epílogo
No estudo que examinamos hoje, os cientistas foram capazes de demonstrar uma reprogramação temporária de células que podem combater os sinais do envelhecimento celular e não afetar a identidade celular.Células de idosos que passaram por reprogramação começam a demonstrar as características das células jovens após alguns dias. Nesse caso, o efeito persiste por seis dias após a interrupção do tratamento.Essa técnica é importante não apenas em termos de rejuvenescimento geral das células e tecidos, mas também mais especificamente no aspecto do combate aos efeitos de doenças relacionadas à idade, como a osteoartrite.No futuro, os cientistas pretendem melhorar sua metodologia. Em primeiro lugar, como dizem os próprios pesquisadores, é necessário realizar muitos testes em laboratório e verificar completamente a segurança do método no nível celular. Depois disso, será possível iniciar seu uso no nível do tecido.A humanidade está pronta para a juventude eterna em termos de moralidade, ética e psicologia? A pergunta é complexa, mas tem muitas respostas. No entanto, o objetivo deste estudo não está na busca da imortalidade, mas na busca de novos métodos eficazes de combate a várias doenças que surgem em conexão com o inevitável envelhecimento do corpo. A velhice não é tão ruim quanto as doenças que a acompanham. O mesmo pode ser dito sobre qualquer época, pois que alegria há na mítica eterna juventude, se por toda essa eternidade uma pessoa luta com alguma dor?Sexta-feira off-top:
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