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“Olha, isso é alguma coisa”: auto-replicação do DNA artificial



Uma das principais características distintivas de qualquer organismo vivo é a capacidade de salvar e reproduzir as informações necessárias para criar seu próprio tipo. Isso se manifesta principalmente na replicação do DNA, quando um par de filhas aparece no mesmo DNA pai, que é uma cópia exata de seu progenitor. Na natureza, esse processo é observado em todos os lugares, mas é extremamente difícil recriá-lo sob condições de laboratório a partir do zero, porém, é bastante realista.

Cientistas do Instituto de Bioquímica. Max Planck (Alemanha) criou com sucesso um sistema biológico capaz de replicar seu próprio DNA. Quais técnicas foram usadas para criar DNA replicante sintético, qual a eficácia do sistema resultante e o que essa descoberta significa para a biologia sintética moderna? Encontraremos respostas para essas perguntas no relatório dos cientistas. Vai.

Base de estudo


No campo da criação de sistemas biológicos artificiais, a capacidade de replicar é um aspecto essencial da utilidade do sistema criado. Segundo os cientistas, isso pode ser alcançado através da implementação dos componentes básicos: replicação * , transcrição * e tradução de DNA * .
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Em outras palavras, para criar uma vida artificial completa, é necessário implementar a reprodução auto-codificada, ou seja, auto-replicação. Este é um processo extremamente complicado e confuso.

Os autores do estudo observam que, em sistemas baseados na bioquímica existente, por exemplo, MPC ( células mínimas baseadas em proteínas) , a auto-replicação requer um repensar completo da biologia molecular, incluindo replicação, transcrição e tradução de DNA, levando em consideração um ambiente completamente livre de células.

A síntese de proteínas a partir do DNA pode ser alcançada em certos sistemas recombinantes baseados em polimerases de fago * RNA - as principais partes do mecanismo de tradução de Escherichia coli e o sistema de regeneração mínima de energia, isto é, PURE - Síntese de proteínas usando elementos recombinantes (síntese de proteínas usando elementos recombinantes).
Bacteriófagos ou fagos * são vírus que infectam seletivamente células bacterianas e arqueadas. Em biologia, é usado como vetor (DNA para transferir material genético para a célula).
Enquanto isso, continua sendo extremamente difícil recriar o processo de replicação de DNA do genoma com base na transcrição e tradução (TTcDR - transcrição - replicação de DNA acoplada à tradução ), que codifica todos os componentes macromoleculares do sistema PURE usando replicoma auto-codificado * .
Replisoma * é um complexo multiproteico que replica o DNA bacteriano.
A replicação de DNA com base nas polimerases de DNA (DNAP) de fagos (por exemplo, Phi29) pode ajudar a implementar a técnica TTcDR.

No entanto, no método TTcDR, o genoma Phi29 em tamanho real poderia ser alcançado apenas bloqueando alguns dos fatores de replicação.

Todos os métodos acima têm suas vantagens teóricas, mas na prática eles não deram um resultado completo. No trabalho que estamos considerando hoje, os cientistas descrevem um sistema de tradução que fornece replicação auto-codificada e expressão de grandes genomas de DNA em condições livres de células bem definidas. Em particular, a auto-replicação do genoma de mais de 116 kb foi alcançada. (mil pares de nucleotídeos), cobrindo toda a gama de fatores de tradução Escherichia coli(Escherichia coli), todos os três RNAs ribossômicos, o sistema de regeneração de energia, bem como as polimerases de RNA e DNA * .
A polimerase * é uma enzima que realiza a síntese de polímeros de ácidos nucléicos. A DNA polimerase sintetiza o DNA e a RNA polimerase sintetiza o RNA. Esse processo prossegue através da cópia complementar do DNA ou RNA dos pais.
Além disso, o sistema criado demonstrou a capacidade de sintetizar mais de 30 fatores de tradução, metade dos quais se expressa em quantidades iguais ou superiores às introdutórias.

Resultados da pesquisa


No primeiro estágio, os cientistas testaram o TTcDR auto-codificado e dependente de Phi29-DNAP usando o protocolo padrão do sistema PURExpress .

A região de codificação Phi29-DNAP flanqueada pelo promotor * T7 foi primeiro clonada no vetor pCR-Blunt TOPO (pREP, 1a ).
O promotor * é uma sequência nucleotídica de DNA usada pela RNA polimerase como uma região para o início da transcrição.


Imagem nº 1

Em teoria, essa arquitetura deve fornecer replicação espontânea de RNA como um anel circular * usando DNAP auto-codificado sem proteínas adicionais de replicação ou iniciadores de DNA fornecidos externamente.
A replicação do tipo anel de rolamento * é um processo de replicação unidirecional de ácido nucleico durante o qual ocorre uma síntese rápida de várias cópias de moléculas de DNA ou RNA do anel.
No entanto, usando a reação PURExpress padrão com dNTP (nucleotídeo contendo desoxirribose C 5 H 10 O 4 ) e pREP 4 nM (meio LB suplementado com zeocina C 55 H 86 N 20 O 21 S 2 ), a síntese de DNA não foi detectada usando eletroforese em gel de agarose * , nem por reação em cadeia da polimerase em tempo real * ( 1b e 1c ).
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Para melhorar a replicação do DNA sem o envolvimento de sistemas PURE especializados, foi decidido otimizar o protocolo de reação padrão do PURExpress. Para isso, o número relativo de fatores de tradução, ribossomos e um agente redutor foi aumentado, diminuindo os níveis de tRNA (RNA de transporte) e rNTP (trifosfato de ribonucleosídeo) ( 1d ).

Usando esta composição PURE otimizada (PURErep), foi possível obter uma replicação de ~ 5 a 12 vezes das unidades monoméricas de pREP nas reações TTcDR ( 1b e 1e ). A síntese em tamanho total de pREP foi confirmada por digestão com MluI * do produto de replicação ( 1c ).
MluI * é uma endonuclease de restrição disponível comercialmente, isto é, uma enzima que catalisa a hidrólise de ácidos nucleicos.
A expressão da proteína verde fluorescente (sfGFP) foi utilizada como fator de avaliação da atividade de tradução. Verificou-se que uma alteração na composição do PURE levou a uma diminuição na síntese de proteínas em 20-40% em comparação com o PURE sem TTcDR. No entanto, essa diminuição na expressão da proteína permanece aceitável, dada a compatibilidade melhorada do sistema PURErep com a replicação do DNA.

A análise da replicação do DNA com base no qPCR revelou um tempo de duplicação estável (1-2 horas) para várias concentrações iniciais da matriz, enquanto a replicação do DNA continuou mesmo após 24 horas a 30 ° C ( 1e ).

O TTcDR também ficou estável por mais de cinco gerações de diluição sequencial quando apenas 4% do produto final da reação PURErep / pREP foi transferido diretamente para a nova mistura PURErep ( 1f) A principal conclusão desta observação é que os produtos TTcDR podem servir de modelo para a auto-replicação do DNA por várias gerações.

Os cientistas observam que uma quantidade significativa de produto com baixa mobilidade eletroforética é típica para replicação como um anel rotativo, o que foi observado durante os experimentos. Esses produtos de reação podem ser representados por concorredores de alto peso molecular * e / ou aglomerados de DNA / MgPPi.
Concatemer * - várias cópias de sequências de DNA montadas em um cluster seqüencial.
A formação de produtos com um tamanho de ~ 5 kb também foi detectada. em amostras não tratadas. Segue-se que as reações TTcDR podem produzir quantidades significativas de cópias monoméricas de pREP.

Além disso, os cientistas conseguiram transformar os produtos de E. coli após a remoção do plasma original. Os produtos da reação purificada resultantes eram idênticos em tamanho aos pREPs monoméricos.

No estágio seguinte, os cientistas decidiram criar um conjunto de genes que codificam os componentes importantes da reação PURE: 31, um fator de tradução essencial (FT) da bactéria E. coli .

Para isso, TTcDR de pREP (4,6 kb) foi estudado em conjunto com cada um dos três plasmídeos grandes *: pLD1 (30 pb, 13 FT), pLD2 (20 pb, 8 FT) e pLD3 (23 pb, 9 FT). Todos eles foram clonados para fornecer expressão recombinante de 30 dos 31 fatores de tradução da bactéria E. coli .
Os plasmídeos * são pequenas moléculas de DNA capazes de replicação independente.
Os produtos TTcDR de todos os quatro plasmídeos (incluindo pREP) mostraram características idênticas de restrição MluI: plasmídeos clonais, tipicamente propagados em E. coli ( 2a ).


Imagem No. 2

Também vale a pena notar que os produtos pLD TTcDR podem ser diretamente transformados em E. coli , onde são armazenados como plasmídeos monoméricos.

A mistura PURErep modificada também forneceu replicação completa de todos os três plasmídeos pLD juntamente com PURErep durante a reação em um meio comum ( 2b ).

Os cientistas não pararam por aí e, na etapa seguinte do estudo, tentaram expandir a carga genética do sistema TTcDR co-replicando plasmídeos que codificam componentes adicionais do sistema PURE: EF-Tu (pEFTu), ausente no sistema pLD, bem como o RNA ribossômico operon * rrnB ( O prRNA é um rRNA precursor que codifica 23S rRNA (RNA ribossômico), 16S rRNA, 6S rRNA e 6RrNA e tRNA (RNA de transporte, neste caso Glu2) ( 2c ).
Operon * é uma unidade funcional do genoma unicelular, que inclui genes que codificam proteínas.
As experiências de QPCR visando amplicons específicos para plasmídeos * confirmaram que as unidades monoméricas de todos os seis plasmídeos (comprimento total de DNA foi de 93 kb) replicaram cerca de 2-8 vezes em comparação com o número original ( 2c ).
Amplicon * é uma unidade de amplificação extracromossômica ( cópia de seções de DNA).
Confirmação adicional do sucesso da replicação articular do plasmídeo foi a formação de colônias resistentes à zeocina (pREP) ou à canamicina (plasmídeo pLD e prRNA) ou à carbenicilina (pEFTu). Essas colônias foram o resultado da transformação dos produtos da reação PURErep tratados com DpnI ( 2d ).

As 26 colônias clonais selecionadas seguidas por análise de restrição confirmaram mais uma vez o sucesso do TTcDR de todos os seis plasmídeos ( 2e ).

Usando o mesmo método descrito anteriormente, os cientistas realizaram outro procedimento para replicação conjunta de cinco plasmídeos adicionais: genes para o sistema de regeneração mínima de trifosfato de nucleosídeo com base em creatina quinase (pCKM), adenilato quinase (pAK1) e difosfato quinase nucleosídeo (pNDK); bem como a RNA polimerase T7 (T7RNAP) e pirofosfatase (pIPP).


Imagem No. 3

Com um tamanho total de 116,3 kb esse conjunto de 11 plasmídeos atinge> 100% do comprimento estimado do genoma proposto para um sistema mínimo e auto-replicante que depende apenas de nutrientes de baixo peso molecular ( 3a ).

Os cientistas decidiram então verificar se o PURErep pode fornecer expressão gênica paralela durante a replicação. Para isso, foi examinada a expressão multicistrônica de FT codificada em três plasmídeos de pLD: pLD1, pLD2 e plD3 (não incluindo pEFTu).

A fim de investigar se o PURErep é geralmente capaz de suportar a expressão multicistrônica desses plasmídeos, foi realizada a expressão sem células de cada plasmídeo individual na presença de BODIPY-Lys-tRNALys, que fornece a marcação por fluorescência dos produtos de tradução.

A fim de melhorar a sensibilidade de detecção e permitir a quantificação de proteínas recém-sintetizadas, uma análise quantitativa da expressão de proteínas foi realizada ainda com base na espectrometria de massa usando marcadores isotópicos estáveis.


Imagem No. 4

Esta análise forneceu evidências convincentes para a síntese de todas as subunidades FT de proteínas codificadas por pLD ( 4a ). Também foi observada regeneração parcial ou completa de proteínas codificadas em pLD2 e pLD3.

A análise da expressão mostrou que, mesmo em PURErep não modificado em combinação com pREP, há uma replicação completa de 32 FT cidrons codificados por pLD e expressão de cerca de metade das cadeias peptídicas FT codificadas, cujo número corresponde ou excede o inicial.

Para um conhecimento mais detalhado das nuances do estudo, recomendo que você analise o relatório dos cientistas e materiais adicionais .

Epílogo


Neste trabalho, os cientistas conseguiram alcançar o que muitos de seus colegas anteriormente só podiam sonhar - criando um sistema artificial capaz de se auto-replicar.

Dizer exageradamente isso significa que eles foram capazes de dar os primeiros passos para criar um sistema que se auto-reproduzisse, simulando os processos biológicos o máximo possível.

Os autores do estudo estão extremamente satisfeitos com os resultados e planejam expandir o genoma artificial com segmentos adicionais de DNA no futuro. Eles querem criar um sistema com uma concha que possa manter a viabilidade, absorvendo nutrientes e descartando resíduos. Essa estrutura artificial pode ser usada como um bio-dispositivo de produção especializado para substâncias naturais ou como base para a criação de sistemas ainda mais complexos.

A clonagem é um processo complexo, do qual não há dúvida, mas a criação de um sistema sintético completo e viável é um nível completamente diferente. Alguém dirá que esses estudos são perigosos, porque ninguém tem o direito de assumir as responsabilidades da mãe natureza. No entanto, a curiosidade de uma pessoa é quase impossível de se acalmar. Nosso desejo de entender tudo e repetir tudo é um dos fatores determinantes no progresso da ciência. Para melhor ou pior, esta é uma pergunta para a qual não há uma resposta única. Só podemos admirar as conquistas das mentes brilhantes e olhar cautelosamente para o futuro, enquanto esperamos uma utopia.

Obrigado pela atenção, fique curioso e tenha um ótimo final de semana a todos, pessoal! :)

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