🔔 🏴󠁧󠁢󠁥󠁮󠁧󠁿 🌜 Sars ajaib? Silsilah dari Coronavirus Wuhan 🍼 🧔 👧

Tidak, well, apa itu buatan manusia? Omong kosong macam apa? Saya pikir ketika saya pertama kali mendengar hipotesis bahwa Kovid-19 disebabkan oleh kebocoran laboratorium, atau bahkan oleh serangan bio yang ditargetkan. Dan setiap kali dia mengabaikan spekulasi-spekulasi ini ketika mereka sekali lagi berenang mendekati saya dalam aliran badai coronavirus infoshum. Nah, pikirkan itu, ada lembaga virologi di Wuhan, Anda tidak pernah tahu.

Pada titik tertentu, sudah perlu untuk mengabaikannya secara wajar, karena para pendukung kegilaan manusia mulai membuktikan tesis mereka tentang kemungkinan sifat buatan virus dengan argumen dari biologi molekuler, dan di sini saya sudah ingin menghancurkan teori konspirasi mereka dengan fakta ilmiah yang dingin. Nah, jika bukan sebagai penulis artikel di Nature (menurut saya), maka setidaknya seperti yang dihormati oleh Panchin oleh saya .

Dan di sini, dalam mengejar argumen melawan virus buatan manusia, virus keraguan menginfeksi saya. Apa, sebenarnya, alasan untuk keraguan? Fakta bahwa semakin dalam Anda terlibat dalam aktivitas coronavirusologist selama 15-20 tahun terakhir, semakin baik Anda memahami bahwa membuat chimera seperti CoV2 adalah hal yang lumrah di dalamnya. Dan CoV2 adalah chimera yang jelas berdasarkan strain kelelawar RaTG13, di mana situs pengikatan reseptor (RBM) dalam protein lonjakan diganti dari kelelawar oleh pangolinium, dan di samping itu, bagian khusus dari 4 asam amino dimasukkan, yang menciptakan situs pembelahan furin, yang, seperti ahli virologi sebelumnya telah menemukan bahwa secara signifikan memperluas "repertoar" virus dalam hal di mana sel-sel itu dapat ditembus.Kemungkinan besar, itu berkat situs furin baru ini bahwa mutan baru berhasil melompat dari operator asli ke manusia.

Mempertimbangkan ketinggian yang telah dicapai rekayasa genetika saat ini, mensintesis CoV2 menggunakan metode yang dijelaskan di atas tidak akan sulit bahkan untuk spesialis pemula. Memang, ahli virologi, termasuk Shi Zhengli , kepala departemen coronavirus di Institut Virologi Wuhan , telah berulang kali terlibat dalam hal-hal seperti itu - seperti mengganti RBM dalam satu jenis virus dengan RBM dari yang lain(Ini adalah karya kelompok Shi Zhengli dari 2007), dan dengan menambahkan situs furin baru yang dapat memberikan coronavirus spesifik pada satu spesies hewan peluang untuk mulai menggunakan reseptor ACE2 dari spesies lain.

Menit Perawatan UFO

Pandemi COVID-19, infeksi pernafasan akut yang berpotensi parah yang disebabkan oleh coronavirus SARS-CoV-2 (2019-nCoV), telah secara resmi diumumkan di dunia. Ada banyak informasi tentang Habré tentang topik ini - selalu ingat bahwa Habré dapat diandalkan / bermanfaat, dan sebaliknya.

Kami mendesak Anda untuk kritis terhadap informasi apa pun yang dipublikasikan.

Sumber resmi
C
C
()

, .

Cuci tangan, rawat orang yang Anda cintai, tinggal di rumah kapan saja memungkinkan dan bekerja dari jarak jauh.

Baca publikasi tentang: coronavirus | kerja jarak jauh

Shi Zhengli di laboratoriumnya di Institut Virologi Wuhan

Tapi sebelum membiakkan konspirasi di sini, mari kita mempelajari bio ogy.

Biologi

Jadi, mari kita mulai dari kompor. Seperti apa situs furin, RBM seperti apa, seperti apa protein lonjakan pada umumnya? Bahkan, jika Anda mengarungi hutan terminologi, maka semuanya secara konsep sederhana. Sebagai contoh, protein runcing adalah hal yang paling menonjol dari partikel virus (protein S), di mana virus ini “dinobatkan”:

Dengan bantuan protein-protein inilah virion menempel pada reseptor sel korban (ACE2 dalam kasus kami), kemudian menembus ke dalam. Oleh karena itu, kita dapat mengatakan bahwa ini adalah bagian terpenting dari virus, karena ia menentukan hewan mana yang dapat memengaruhi dan mana yang tidak - reseptor ACE2 pada spesies yang berbeda sedikit berbeda secara struktural. Pada saat yang sama, dari keseluruhan genom 30 kilobase besar menurut standar virus, gen protein ini hanya 12-13%, yaitu sekitar 1300 asam amino. Ini adalah bagaimana protein lonjakan terstruktur dalam CoV2 dan kerabat dekatnya:

Seperti yang dapat dilihat dari gambar di atas, protein S terdiri dari dua subunit: S1 dan S2. Ini adalah S1 yang berinteraksi dengan reseptor ACE2, dan tempat yang dilakukannya disebut Domain Penerima Reseptor (RBD), dan area kontak langsung, tempat maha kudus, disebut Reseptor Binding Motif (RBM). Berikut ini adalah ilustrasi yang indah dari sebuah karya yang sama indahnya :

RBD CoV2, ACE2.
() 2019-nCov. NTD, N- . RBD, - . RBM, - . SD1, 1. SD2, 2. FP, . HR1, 1. HR2, 2. TM, . IC, .
() RBD 2019-nCov. RBM .
() RBD 2019-nCov, ACE2. ACE2 . RBD 2019-nCoV , RBM — . RBD 2019-nCov . N- ACE2, , .
Overall structure of 2019-nCoV RBD bound with ACE2.
(a) Overall topology of 2019-nCoV spike monomer. NTD, N-terminal domain. RBD, receptor-binding domain. RBM, receptor-binding motif. SD1, subdomain 1. SD2, subdomain 2. FP, fusion peptide. HR1, heptad repeat 1. HR2, heptad repeat 2. TM, transmembrane region. IC, intracellular domain.
(b) Sequence and secondary structures of 2019-nCoV RBD. The RBM is colored red.
() Overall structure of 2019-nCoV RBD bound with ACE2. ACE2 is colored green. 2019-nCoV RBD core is colored cyan and RBM is colored red. Disulfide bonds in the 2019-nCoV RBD are shown as stick and indicated by yellow arrows. The N-terminal helix of ACE2 responsible for binding is labeled.

Jadi disini. Ketika genom CoV2 hanya didekripsi, pada awalnya tidak ada strain yang terkait langsung dengan itu yang diketahui. Tetapi sudah pada 23 Januari 2020, Shi Zhengli merilis sebuah karya di mana dia mengumumkan bahwa CoV2 adalah 96% bertepatan dengan strain RaTG13, yang laboratoriumnya pada tahun 2013 diisolasi dari kelelawar Yunnan. Benar, di luar laboratoriumnya hingga Januari 2020, tidak ada yang tahu tentang ketegangan ini.

Segera jelas bahwa RaTG13 adalah bocah istimewa. Lihatlah grafik:

Ini adalah grafik kemiripan CoV2 dengan strain yang dikenal lainnya. Semakin tinggi kurva, semakin tinggi persentase pencocokan nukleotida. Seperti yang Anda lihat, di wilayah gen protein yang sangat runcing (S), hanya RaTG13 yang kurang lebih dekat dengan CoV2, dan semua jenis lain di tempat ini mencapai puncaknya - kedua jenis virus dari kelelawar lain dan SARS-CoV pertama (kurva merah) ) Namun sejauh ini tidak ada yang mencurigakan - apakah ada galur yang tidak diketahui dari gua-gua Yunnan yang masih memiliki galur sains yang tidak diketahui? Ya, tidak begitu jelas bagaimana sebenarnya virus itu sampai ke Wuhan dari sana, tetapi apa yang tidak terjadi.

Pangolin

Kemudian trenggiling muncul di tempat kejadian: pada bulan Februari, kelompok ilmuwan Cina lainnya menemukan di dalam tong mereka strain pangolin coronavirus, yang, meskipun umumnya lebih buruk daripada RaTG13, mirip dengan CoV2 (90%), dalam hal itu protein lonjakan RBM hampir identik - itu berbeda hanya untuk 1 asam amino (lihat dua urutan atas, titik-titik berarti kebetulan dengan urutan pertama):

Selain itu, pada kuartal pertama protein S, galur pangolinium tidak mirip dengan CoV2, dan urutan setelah RBM pada ketiga galur (CoV2, Pangolin, RaTG13) kurang lebih bertepatan. Tetapi RTG13 RBM itu sendiri sangat berbeda dari CoV2, yang dapat dilihat dari kemiringan tajam grafik RaTG13 hijau dibandingkan dengan grafik CoV2 merah di wilayah RBM (batang vertikal merah muda) pada grafik berikut:

Perbedaan ini juga dikonfirmasi oleh analisis filogenetik dari tiga area yang disorot dalam grafik di atas - menurut RBM, strain trenggiling lebih dekat ke CoV2 daripada RaTG13, tetapi di kiri dan kanan RBM ke CoV2 lebih dekat ke RaVG13. Artinya, ada rekombinasi yang jelas, seperti yang disebutkan oleh penulis sendiri dan beberapa karya lainnya.

Ngomong-ngomong, dari mana trenggiling datang dari para peneliti? Dan dari sini:

Mereka disita dari penyelundupan oleh bea cukai Tiongkok dan dipindahkan ke pusat rehabilitasi di Guangdong, di mana mereka mati dengan gejala coronavirus yang parah. Ini, tentu saja, tidak bisa tidak menarik virologis lokal, yang mengisolasi biomaterial berbeda dari mereka:

, , - 2019 . (Manis pentadactyla) 25 (Manis javanica). ; , , . , , , , , , .
Pangolins used in the study were confiscated by Customs and Department of Forestry of Guangdong Province in March-December 2019. They include four Chinese pangolins (Manis pentadactyla) and 25 Malayan pangolins (Manis javanica). These animals were sent to the wildlife rescue center, and were mostly inactive and sobbing, and eventually died in custody despite exhausting rescue efforts. Tissue samples were taken from the lung, lymph nodes, liver, spleen, muscle, kidney, and other tissues from pangolins that had just died for histopathological and virological examinations.

Ngomong-ngomong, dan bukan hanya lokal, karena peneliti Cina lainnya (Hong Kong dalam kasus ini) juga menerima sampel trenggiling yang disita dan pada bulan Februari 2020 juga merilis karya serupa , mencatat tanda-tanda rekombinasi yang jelas pada protein lonjakan CoV2:

Kami menerima sampel jaringan beku (paru-paru, usus, darah) yang diambil dari 18 trenggiling Melayu ( Manis javanica ) selama Agustus 2017 - Januari 2018. Trenggiling ini diperoleh selama operasi anti-penyelundupan oleh Bea Cukai Guangxi. Sungguh menakjubkan bahwa sequencing berkinerja tinggi dari RNA mereka mengungkapkan adanya coronavirus di enam (dua paru-paru, dua usus, satu campuran paru-paru dan usus, satu darah) dari 43 sampel.
...
, , , RaTG13 2019-CoV2 (. 1c, d). , 2019-CoV2 - (RBD; 97,4%; . 1c . 2a), 2019-CoV2 RaTG13. RaTG13 2019-CoV2 89,2% RBD. 2019-CoV2 RBD, RaTG13 2019-CoV2 ( 442, SARS-CoV ).
We received frozen tissue (lungs, intestine, blood) samples that were collected from 18 Malayan pangolins (Manis javanica) during August 2017-January 2018. These pangolins were obtained during the anti-smuggling operations by Guangxi Customs. Strikingly, high-throughput sequencing of their RNA revealed the presence of coronaviruses in six (two lung, two intestine, one lung-intestine mix, one blood) of 43 samples. With the sequence read data, and by filling gaps with amplicon sequencing, we were able to obtain six full or nearly full genome sequences — denoted GX/P1E, GX/P2V, GX/P3B, GX/P4L, GX/P5E and GX/P5L — that fall into the 2019-CoV2 lineage (within the genus Betacoronavirus) in a phylogenetic analysis (Figure 1a).
…
More notable, however, was the observation of putative recombination signals between the pangolins coronaviruses, bat coronaviruses RaTG13, and human 2019-CoV2 (Figure 1c, d). In particular, 2019-CoV2 exhibits very high sequence similarity to the Guangdong pangolin coronaviruses in the receptor-binding domain (RBD; 97.4% amino acid similarity; indicated by red arrow in Figure 1c and Figure 2a), even though it is most closely related to bat coronavirus RaTG13 in the remainder of the viral genome. Bat CoV RaTG and the human 2019-CoV2 have only 89.2% amino acid similarity in RBD. Indeed, the Guangdong pangolin coronaviruses and 2019-CoV2 possess identical amino acids at the five critical residues of the RBD, whereas RaTG13 only shares one amino acid with 2019-CoV2 (residue 442, human SARS-CoV numbering).

Ngomong-ngomong, penulis artikel ini juga menyoroti morfisitas filogenetik eksplisit dari protein lonjakan CoV2:

Menariknya, analisis filogenetik dari satu-satunya situs yang identik di RBD menunjukkan bahwa posisi filogenetik dari trenggiling guangdong konsisten dengan posisi genom virus lainnya, yaitu bahwa itu bukan kerabat terdekat 2019-CoV2 (Gambar 2b). Oleh karena itu, ada kemungkinan bahwa kesamaan asam amino dalam RBD dari virus pangolin corona dan 2019-CoV2 adalah karena evolusi konvergen yang dimediasi secara selektif daripada rekombinasi, meskipun sulit untuk memilih di antara skenario-skenario ini berdasarkan data yang tersedia.
Sumber teks
Interestingly, a phylogenetic analysis of synonymous sites alone in the RBD revealed that the phylogenetic position of the Guangdong pangolin is consistent with that in the remainder of the viral genome, rather than being the closest relative of 2019-CoV2 (Figure 2b). Hence, it is possible that the amino acid similarity between the RBD of the Guangdong pangolin coronaviruses and 2019-CoV2 is due to selectively-mediated convergent evolution rather than recombination, although it is difficult to choose between these scenarios on current data.

Diterjemahkan dari ilmiah, kata-kata penulis berarti bahwa jika kita menganalisis seluruh RBD dari tiga strain, membuang perbedaan yang jelas (substitusi non-sinonim) di antara mereka, yang terutama disebabkan oleh RB M (yang, saya ingat, identik antara CoV2 dan Pangolin), dan membangun pohon filogenetik oleh substitusi sinonim, CoV2 tetap lebih dekat dengan RaTG13, dan tidak dengan strain trenggiling. Yang agak aneh mengingat fakta bahwa pangoliniy dengan CoV2 memiliki RBM yang identik (yaitu, segmen di dalam RBD).

Para penulis lebih lanjut berteori bahwa ini mungkin hasil dari evolusi konvergen, yaitu, dengan kata lain, bahwa strain CoV2 dan trenggiling datang ke RBM identik masing-masing dengan cara mereka sendiri, dan bukan melalui rekombinasi bersama nenek moyang yang sama. Karena itu benar-benar sangat aneh bahwa rekombinasi harus terjadi - seolah-olah seseorang baru saja mengambil sepotong RBM dari strain trenggiling dan menggantinya dengan RBM di RaTG13. Dan ini tidak seperti evolusi, tetapi, maafkan Darwin, Desain Cerdas.

Silsilah Orang Mahkota

Untuk lebih memahami asal-usul CoV2, mari kita lihat lagi urutan protein lonjakan dalam trinitas kita: CoV2, RaTG13 dan trenggiling - bandingkan perbedaan berpasangan di antara mereka (asam amino identik ditandai dengan titik-titik, huruf merah menunjukkan perbedaan, dan tanda hubung menunjukkan perbedaan, dan tanda hubung menunjukkan dihapus / ditambahkan asam amino) :

Dapat dilihat dengan mata telanjang bahwa pada kuartal pertama urutan, strain pangolinium jauh dari CoV2 dan RaTG13. Nah, RaTG13, jika bukan untuk plot di wilayah RBM (persegi panjang merah), akan sangat dekat dengan CoV2. Tapi, seperti yang sudah saya katakan, situs yang sama di CoV2 paling dekat dengan strain trenggiling.

Ngomong-ngomong, bagaimana dengan strain trenggiling lainnya? Mari kita lihat. Bagaimanapun, sejauh ini kami hanya menganalisis virus yang diisolasi dari trenggiling yang disita oleh bea cukai pada tahun 2019. Dan ada juga sejumlah trenggiling yang disita pada tahun 2017, dan mereka juga memiliki jenis yang sama. Jika kita membandingkan RaTG13 dengan genom virus dari trenggiling tahun 2017 dan 2019, maka semuanya juga menarik di sini:

Pada kuartal pertama protein S, galur pangolin dari 2017 lebih dekat dengan RaTG13 (dan CoV2) dibandingkan dengan mitra pangolin dari 2019 (MP789). Pada saat yang sama, ketiganya memiliki nenek moyang yang sama jelas baru-baru ini di daerah yang disorot oleh persegi hijau, dan di daerah ini RaTG13 dan pangolin-19 (MP789) lebih dekat daripada pangolin-17, karena memiliki beberapa mutasi umum dengan RaTG13 (dilingkari merah) dan elips biru), yang tidak diamati dalam legenda-17. Pada saat yang sama, RBM untuk ketiganya berbeda dan berbeda dalam proporsi yang hampir sama, dan di tempat yang sama.

Mungkin, bahkan setelah nenek moyang RaTG13 dan MP789 berpisah, MP789 menggantikan sebagian besar pada kuartal pertama protein S (yang tidak terjadi pada RaTG13 dan pangolin-17), dan sisa protein S tetap umum untuk ketiganya. Dan kemudian jalur gen RaTG13 dan MP789 berkumpul kembali dan dengan semangat yang kuat melahirkan CoV2. Mungkin juga leluhur RaTG13 adalah hasil rekombinasi leluhur dari strain trenggiling.

Penasaran juga untuk melihat mutasi identik yang agak unik (QTQTNS) di RaTG13 dan trenggiling-19 tepat di depan tempat CoV2 memiliki situs pembelahan furin baru, yang muncul karena penyisipan 4 asam amino baru di tempat ini (PRRA). Jika Anda melihat urutan nukleotida di sekitar mutasi yang sama ini, Anda dapat melihat bahwa RaTG13 dan CoV2 lebih dekat satu sama lain daripada pangolin-19, karena mereka berhasil mengumpulkan beberapa mutasi umum (disorot dengan warna biru):

Omong-omong, dengan Orf1ab, CoV2 juga memiliki lompatan filogenetik: 1a lebih dekat dengan RaTG13, tetapi 1b lebih dekat dengan trenggiling-19:

Artinya, ternyata leluhur CoV2 berdosa dengan leluhur umum trenggiling-19, paling tidak dua kali lipat? Untuk pertama kalinya - ketika ia (bersama dengan leluhur bersama dengan RaTG13) mewarisi Orf1ab dan bagian kedua dari protein mirip lonjakan dengan mutasi QTQTNS, dan kedua - ketika ia memperoleh 1b bersama dengan RBM, yang sudah berbeda dari RaTG13. Tidak, tentu saja, ini mungkin dan itu sendiri tidak terlalu penting - setelah semua, virus ini bermutasi dan bergabung kembali secara konstan. Pertanyaan lain adalah di mana tepatnya kelelawar dan virus trenggiling dapat ditemukan satu sama lain untuk pesta pora seperti itu - di gua-gua pegunungan, "pasar basah", tempat perlindungan bagi hewan yang disita, atau bahkan di laboratorium. Tapi mari kita luangkan waktu sejenak dengan pertanyaan-pertanyaan ini. Pertama, pertimbangkan aspek paling menarik dari virus baru - sidebar asam 4-amino yang mengubahnya menjadi super-killer.

Saya memukul dengan rapi, tetapi sulit

Sangat tidak mungkin untuk mengabaikan kotak PRRA ini antara S1 dan S2. Sebagai serpihan itu menonjol dalam genom CoV2 baru kami. Kotak ini tidak sederhana, tetapi emas. Dia menciptakan situs pembelahan sangat furin , yang saya sebutkan di awal. Binatang seperti apa ini? Saya akan mencoba menjelaskan secara singkat. Ingat struktur protein lonjakan kita? Berikut adalah diagram visual:

Protein terdiri dari dua bagian, S1 dan S2, di mana S1 bertanggung jawab untuk kontak utama dengan reseptor (Domain / Motif Penerima Reseptor yang sama), dan S2 bertanggung jawab untuk fusi dengan membran sel dan penetrasi ke dalam sel. Ia memulai proses fusi yang ditandai dengan peptida fusi kuning, tetapi agar dapat memulai bisnis kotornya, seseorang harus memotong protein S di salah satu situs yang disorot oleh rhombus pada diagram di atas. Virus tidak memiliki "pemotong" sendiri (ada yang lain, tapi ini tidak relevan), jadi dia bergantung pada berbagai protease dari korbannya, manfaat dari protease seperti itu, seperti yang bisa kamu pahami dengan banyaknya warna dari rhombus yang sama, ada beberapa jenis. Tetapi tidak semua dari mereka adalah sama, dan tidak semua jenis sel memiliki protease yang dibutuhkan oleh virus. Dan furin hanyalah salah satu yang paling efektif, dan bahkan ia hidup tidak hanya di permukaan sel, tetapi juga di dalam. Yang paling jelas, bahaya situs furin baru ditunjukkan oleh perbedaan antara CoV2 dan "pendahulu" nya SARS-CoV:

Seperti dapat dilihat dari diagram, dalam kasus CoV2, berkat situs furin, bukan dua, tetapi tiga kelas protease (tiga pacmen berwarna) yang dapat memotong protein S-nya di luar sel. Tetapi mungkin perbedaan yang paling penting adalah bahwa furin juga ada di dalam sel, sehingga dapat memotong protein S segera setelah perakitan virion, dengan demikian meningkatkan kemampuan virion baru untuk bergabung dengan sel-sel lain - tanpa meninggalkan box office, sehingga dapat dikatakan.

Ngomong-ngomong, kemungkinan situs furin baru yang memainkan peran penting dalam morbiditas dan mortalitas CoV2 yang bergantung pada usia:

, , , , , SARS-CoV-2. () COVID-19 . SARS-CoV-2 , .
Patients with hypertension, diabetes, coronary heart disease, cerebrovascular illness, chronic obstructive pulmonary disease, and kidney dysfunction have worse clinical outcomes when infected with SARS-CoV-2, for unknown reasons. The purpose of this review is to summarize the evidence for the existence of elevated plasmin(ogen) in COVID-19 patients with these comorbid conditions. Plasmin, and other proteases, may cleave a newly inserted furin site in the S protein of SARS-CoV-2, extracellularly, which increases its infectivity and virulence.

Oh ya, ia memotong protein furin di tempat-tempat yang ditentukan secara ketat, yaitu setelah urutan RxxR (yaitu, Arg-XX-Arg, di mana X dapat menjadi asam amino). Selain itu, jika arginin juga di tempat kedua atau ketiga (yaitu, RRxR atau RxRR), maka efisiensi pembelahan situs ini meningkat secara signifikan.

Oleh karena itu, penampilan situs pembelahan furin baru oleh spesialis segera diperhatikan . Masih akan! Bagaimanapun, tidak ada kerabat terdekat atau bahkan jauh dari Cov2 yang memiliki situs seperti itu - virus corona yang memilikinya hanya 40% dekat dengan Cov2 dalam hal genom:

Ditemukan bahwa semua protein lonjakan dengan homologi protein SARS-CoV-2 lebih besar dari 40% tidak memiliki situs pembelahan furin (Gambar 1, Tabel 1), termasuk Bat-CoV RaTG13 dan SARS-CoV (dengan identitas urutan 97,4 % dan 78,6%, masing-masing). Situs RRAR furin di SARS-CoV-2 memiliki keunikan tersendiri berkat insert PRRA yang unik. Situs ini di SARS-CoV-2 hampir tidak mungkin berevolusi dari MERS, HCoV-HKU1, dll. Dari sekuens yang saat ini tersedia di database, sulit bagi kita untuk menemukan sumbernya. Mungkin ada banyak sekuens intermediate evolusioner yang menunggu penemuan.
Sumber teks
It was found that all Spike with a SARS-CoV-2 Spike sequence homology greater than 40% did not have a furin cleavage site (Figure 1, Table 1), including Bat-CoV RaTG13 and SARS-CoV (with sequence identity as 97.4% and 78.6%, respectively). The furin cleavage site “RRAR” in SARS-CoV-2 is unique in its family, rendering by its unique insert of “PRRA”. The furin cleavage site of SARS-CoV-2 is unlikely to have evolved from MERS, HCoV-HKU1, and so on. From the currently available sequences in databases, it is difficult for us to find the source. Perhaps there are still many evolutionary intermediate sequences waiting to be discovered.

Berikut ini adalah ilustrasi yang jelas dari artikel yang sama dengan kutipan di atas (coronavirus dengan situs furin ditandai dengan warna merah muda, 3 jenis Cov2 ditampilkan pada pukul 10):

Kerabat terdekat dengan situs furin adalah strain HKU5, yang diisolasi oleh tim Shi Zhengli pada tahun 2014 di Guangzhou dari kelelawar genus Pipistrellus (ditambahkan ke GenBank pada tahun 2018). Tapi dia adalah kerabat yang sangat jauh - protein lonjakan mereka bertepatan hanya 36%.

Secara umum, para ilmuwan bingung. Dari mana asal 12 nukleotida ini berasal? Mungkinkah itu buatan manusia? Cukup. Memang, ahli virologi telah berurusan dengan memasukkan seperti itu berulang kali, dan sejak zaman dahulu. Misalnya, orang Amerika memasukkan RRSRR ke dalam protein lonjakan SARS-CoV pertama pada tahun 2006 :

Untuk menyelidiki apakah pembelahan proteolitik pada urutan residu asam amino utama dapat meningkatkan aktivitas fusi sel, kami memutasi protein SARS-CoV seperti spike untuk membuat situs pengenalan furin (RRSRR) di salah satu dari dua tempat.
Sumber teks
To investigate whether proteolytic cleavage at the basic amino acid residues, were it to occur, might facilitate cell–cell fusion activity, we mutated the wild-type SARS-CoV glycoprotein to construct a prototypic furin recognition site (RRSRR) at either position.

Dan Jepang memasukkan situs semacam itu (RRKR) ke dalam protein SARS-CoV pada 2008, meskipun agak hilir:

Pada tahun 2008 yang sama, rekan-rekan Belanda mereka juga mempelajari situs protease ini di SARS-CoV dan membandingkannya dengan murine coronavirus MHV, yang memiliki situs ini (SRRAHR | SV), apalagi, mirip dengan situs CoV2 kami (SPRRAR | SV):

Pada tahun 2009, kelompok Amerika lainnya juga memutuskan untuk mempraktikkan "peningkatan" SARS-CoV dan, tanpa mengubah tradisi Amerika untuk tidak meremehkan arginin, mereka memasukkan RRSRR :

Untuk menyelidiki potensi penggunaan posisi SARS-CoV S1-S2 dan S2 sebagai situs untuk pembelahan proteolitik, kami pertama kali memperkenalkan situs pengenalan pembelahan furin di situs ini dengan membuat mutasi berikut 664-SLLRSTSQSI - SLL RRSRR SI-671 (S1-S2) dan 792-LKPTKRSF-LKRTKRSF-799 (S2 ').
Sumber teks
To examine the potential use of the SARS-CoV S1–S2 and S2? positions as sites for proteolytic cleavage, we first introduced furin cleavage recognition sites at these locations by making the following mutations 664-SLLRSTSQSI — SLLRRSRRSI-671 (S1–S2) and 792-LKPTKRSF — LKRTKRSF-799 (S2?).

Beijing 2019

Tetapi karya serupa terbaru yang saya lihat adalah karya Oktober 2019 oleh para ilmuwan dari Beijing, di mana situs furin baru RRKR dimasukkan tidak dalam pseudovirus, tetapi pada coronavirus ayam asli, virus bronkitis infeksius (IBV):

Ngomong-ngomong, sangat menarik untuk menyebutkan penulis bahwa penambahan situs furin memungkinkan virus mutan untuk menginfeksi sel-sel saraf. Mungkin itu adalah situs CoV2 furin yang menyebabkan beberapa pasien dengan CoV2 menunjukkan gejala neurologis , termasuk kehilangan bau:

S2' QX , , IBV (WT-IBV). , IBV S2 ( -S2) . IBV .
…
, , FP CoV, , , -, , .
Mutation of the S2' site of QX genotype (QX-type) spike protein (S) in a recombinant virus background results in higher pathogenicity, pronounced neural symptoms and neurotropism when compared with conditions in wild-type IBV (WT-IBV) infected chickens. In this study, we present evidence suggesting that recombinant IBV with a mutant S2' site (furin-S2' site) leads to higher mortality. Infection with mutant IBV induces severe encephalitis and breaks the blood–brain barrier.
…
In summary, our results demonstrate that the furin cleavage site upstream of the FP in S protein is an important site for CoV, modulating entry, cell–virus fusion, adaptation to its host cell, cell tropism and pathogenicity, but not antigenicity.

Selain itu, banyak coronavirus memiliki situs furin, tentu saja, ditemukan di alam, dan mereka sangat beragam. Ya, dan mereka dapat muncul sebagai hasil dari mutasi acak. Inilah yang persis terjadi dalam kasus MERS, yang diceritakan kepada kami pada tahun 2015 oleh tim penulis internasional , di antaranya adalah Shi Zhengli dan Ralph Barik, dua bintang coronavirusology sintetis. Kami akan mengingatnya lebih dari sekali, tetapi untuk saat ini beberapa kata tentang artikel itu. Sebenarnya di dalamnya, penulis menunjukkan dua mutasi kunci yang memungkinkan MERS untuk melompat dari kelelawar ke manusia. Dan salah satu dari mutasi ini menyebabkan munculnya situs furin. Benar, ini bukan sekotak asam amino baru, tetapi mutasi yang sudah ada sebelumnya (ditandai dengan warna merah di bawah):

Para penulis tidak hanya menunjukkan, tetapi melekat mutasi ini kembali ke protein lonjakan kelelawar asli, menciptakan mutasi yang sama di dalamnya (yaitu, situs furin), dan menunjukkan bahwa ini memberikan kemampuan untuk menginfeksi sel manusia:

, HKU4 , HKU4, . , S746R N762A, HKU4.
…
, hPPC hECP HKU4 HKU4 . , HKU4 S1/S2, .
To evaluate the potential genetic changes required for HKU4 to infect human cells, we reengineered HKU4 spike, aiming to build its capacity to mediate viral entry into human cells. To this end, we introduced two single mutations, S746R and N762A, into HKU4 spike. The S746R mutation was expected to restore the hPPC motif in HKU4 spike, whereas the N762A mutation likely disrupted the potential N-linked glycosylation site in the hECP motif in HKU4 spike.
…
Therefore, the reengineered hPPC and hECP motifs enabled HKU4 spike to be activated by human endogenous proteases and thereby allowed HKU4 pseudoviruses to bypass the need for exogenous proteases to enter human cells. These results reveal that HKU4 spike needs only two single mutations at the S1/S2 boundary to gain the full capacity to mediate viral entry into human cells.

Ngomong-ngomong, bagaimana mereka melakukan ini dapat menakuti orang-orang yang jauh dari bioteknologi modern itu sendiri - karena penulis memasukkan protein seperti lonjakan coronavirus ini ke dalam retrovirus (HIV) yang tidak aktif:

Secara singkat, retrovirus MERS-CoV-spike pseudotip yang mengekspresikan gen reporter luciferase diperoleh dengan kotransfeksi sel HEK293T dengan plasmid yang membawa gen HIV-1, Env yang mengekspresikan luciferase (pNL4-3.luc.RE-) dan plasmid encoding MERS -CoV protein lonjakan.
Sumber teks
Briefly, MERS-CoV-spike-pseudotyped retroviruses expressing a luciferase reporter gene were prepared by cotransfecting HEK293T cells with a plasmid carrying Env-defective, luciferase-expressing HIV-1 genome (pNL4–3.luc.R-E-) and a plasmid encoding MERS-CoV spike protein.

Mungkin inilah yang mendorong para peneliti India untuk mencari urutan yang serupa dalam HIV dan CoV2 dalam genom (tetapi cetakan mereka dengan cepat dikritik karena metodologi yang tidak berhasil dan kesimpulan yang salah). Faktanya, para ahli menggunakan pseudovirus seperti itu secara teratur, dan secara umum, seseorang tidak perlu takut pada retrovirus sebagai kelas - lentivirus subspesies mereka telah digunakan untuk terapi gen selama bertahun-tahun.

Dari mana RaTG13 berasal

Secara umum, RaTG13 adalah strain yang fenomenal. Sungguh aneh bahwa selama ini, kelompok Shi Zhengli diam tentangnya. Bagaimanapun, ia sama sekali tidak menyerupai saudara-saudaranya yang lain, terutama dalam urutan protein seperti lonjakan, dan ini, saya ingat, justru tempat yang menentukan jenis sel (dan jenis apa) yang dapat ditempel oleh virus ini. Berikut adalah grafik kesamaan genom CoV2 dibandingkan dengan coronavirus kelelawar lainnya (panel B):

RaTG13 adalah kurva merah, dan biru adalah strain yang paling dekat dengan RaTG13 (ZXC21 dan ZC45). Strain ini diisolasi dari sepatu kuda Cina ( Rhinolophus sinicus ) di Zhoushan pada 2015 ( ZXC21 ) dan 2017 ( ZC45 ). Seperti dapat dilihat dari grafik, bahkan mereka sangat sangat berbeda dari RaTG13 (kurva merah) di wilayah protein S. Pada saat yang sama, grafik di atas tidak begitu baik menyampaikan skala jurang di antara mereka sebagai perbandingan langsung dari urutan:

Seperti yang Anda lihat, protein mirip lonjakan ZXC21 dan ZC45 tidak hanya umumnya 23-24 residu asam amino lebih pendek dari protein RaTG13, tetapi mereka lebih pendek di tempat yang paling penting - di RBM (lihat penghapusan di kotak merah yang ditandai dengan garis merah).

Jadi dari mana RaTG13 berasal? Seperti yang saya katakan, pada tahun 2020, Shi Zhengli mengatakan bahwa dia mengisolasinya dari kelelawar tapal kuda (hanya spesies Rhinolophus affinis , bukan R. sinicus ) pada Juli 2013 di Yunnan. Benar, sampai akhir Januari 2020, keberadaannya tidak dilaporkan secara publik, tetapi ketika kelompok Shi Zhengli sendiri menggambarkan penemuannya yang signifikan tentang kemiripannya dengan CoV2 :

, - - (RdRp) (BatCoV RaTG13), Rhinolophus affinis , 2019-CoV2. ( GISAID EPI_ISL_402131). Simplot , 2019-CoV2 RaTG13 (Fig. 1c), 96,2%.
We then found that a short region of RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) from a bat coronavirus (BatCoV RaTG13) — which was previously detected in Rhinolophus affinis from Yunnan province — showed high sequence identity to 2019-CoV2. We carried out full-length sequencing on this RNA sample (GISAID accession number EPI_ISL_402131). Simplot analysis showed that 2019-CoV2 was highly similar throughout the genome to RaTG13 (Fig. 1c), with an overall genome sequence identity of 96.2%.

Tidak tebal: yah, mereka memiliki jenis ini "yang ditemukan sebelumnya" , dan memang begitu. Berbaring di rak. Hingga 2020, hanya bagian genom yang bertanggung jawab untuk RdRp diurutkan di dalamnya. Dari mana dia berasal di rak? Di Yunnan pada 2013 dialokasikan. Dimana tepatnya? Mereka tidak mengatakannya. Di GenBank , juga tidak memiliki informasi ini. Tetapi, untungnya, ada GISAID dalam database genom: dilaporkan bahwa di kota Puer (ya, di tanah air teh kesayangan Basta), seorang pria diisolasi dari usap tinja:

Ini sedikit membuat saya penasaran, karena dalam perjalanan saya di sekitar Pabmed, saya telah menemukan sebuah ekspedisi ke Puer pada musim panas 2013 :

Kelelawar ditangkap di berbagai tempat di lima distrik di empat prefektur Yunnan, Cina, dari Mei hingga Juli 2013.
Sumber teks
Bats were captured from various locations in five counties of four prefectures of Yunnan Province, China, from May to July 2013.

Para peneliti tidak menemukan sesuatu yang sangat menarik bagi kami dalam ekspedisi itu, tetapi mungkin saat itulah Shi Zhengli (atau seseorang dari kelompoknya?) Mengidentifikasi sampel RaTG13 yang sama? Yang mereka urutankan hanya sebagian, tetapi untuk beberapa alasan memutuskan untuk tidak menerbitkan, meskipun sangat berbeda dari semua yang sebelumnya diketahui.

Shi Zhengli sendiri dapat berpartisipasi secara pribadi dalam ekspedisi itu, karena dia berbicara dengan sangat hangat tentang ekspedisi semacam itu - misalnya, dalam penampilannya yang seperti TED pada tahun 2018, di mana dia menunjukkan fotonya dari ekspedisi tersebut:

Itu adalah serangkaian ekspedisi yang membawa ketenaran di seluruh dunia dan julukan "Batumen": dalam sebuah artikel 2013 di Nature , kelompok Shi Zhengli dengan penuh kemenangan mengumumkan bahwa di gua-gua Yunnan dia telah menemukan kelelawar pembawa strain RsSHC014 dan Rs3367 yang bertepatan dengan SARS pertama -CoV masing-masing sebesar 85% dan 96%.

Ngomong-ngomong, itu adalah kebetulan lucu bahwa pada waktu yang hampir bersamaan, di Yunnan yang sama, kelompok Shi Zhengli juga ternyata menemukan strain RaTG13, yang ternyata paling dekat dengan CoV2, dan genom mereka juga bertepatan 96%.

Wuhan-1

Kembali ke artikel kemenangan itu dari 2013, kelompok Shi Zhengli juga mengatakan bahwa dengan membiakkan sampel terisolasi dalam kultur sel monyet Vero , mereka berhasil mengisolasi virus hidup yang hampir identik dengan strain Rs3367 (terdekat dengan SARS-CoV) . Para penulis menjuluki anak mereka WIV1 (di mana WIV singkatan dari Institut Virologi Wuhan):

Yang paling penting, kami melaporkan isolasi pertama dari virus hidup SL-CoV (kelelawar SL-CoV-WIV1) dari sampel yang diisolasi dari kotoran kelelawar dalam sel Vero E6, yang memiliki morfologi coronavirus khas, identitas genom 99,9%. Rs3367 dan menggunakan ACE2 orang, musang dan tulang tapal kuda untuk masuk ke dalam sel. Pengujian in vitro awal menunjukkan bahwa WIV1 juga memiliki tropisme spesies yang luas.
Sumber teks
Most importantly, we report the first recorded isolation of a live SL-CoV (bat SL-CoV-WIV1) from bat faecal samples in Vero E6 cells, which has typical coronavirus morphology, 99.9% sequence identity to Rs3367 and uses ACE2 from humans, civets and Chinese horseshoe bats for cell entry. Preliminary in vitro testing indicates that WIV1 also has a broad species tropism.

Mari kita bandingkan RaTG13 dengan strain Rs3367 dan RsSHC014:

Seperti yang Anda lihat, protein seperti lonjakan dari strain ini tidak hanya lebih pendek dari 13 asam amino RaTG13-shn, tetapi juga sangat berbeda pada kuartal pertama. Ngomong-ngomong, sangat aneh bahwa protein lonjakan di Rs3367 (alias WIV1) dan RsSCH014 hampir identik, dan hanya berbeda di wilayah RBD (urutan kanan di bawah). Hampir seperti CoV2 dan RaTG13 (tidak termasuk insert furin):

Bisakah seorang peneliti, setelah menerima sampel koronavirus dari pangolin sitaan yang disita pada bulan Maret 2019, ingin memeriksa bagaimana pangolinium RBM bersifat tropis bagi reseptor manusia? Dan bagaimana jika dengan situs furin polibasa di tempat yang paling menarik? Ini akan jadi bom!

Secara teoritis, tentu saja, dia bisa. Tidak ada yang secara teknis sulit bagi ahli virus untuk melakukan percobaan seperti itu. Sebuah pertanyaan yang masuk akal: mengapa mereka menggunakan RaTG13 sebagai dasar, dan belum menguji WIV1? Tapi mungkin saja mereka juga menguji chimera dengan WIV1. Dan secara paralel, mereka memutuskan untuk mensimulasikan varian rekombinasi virus trenggiling dengan kelelawar yang lebih dekat dengannya - toh, RaTG13 tetap lebih dekat dengan galur trenggiling daripada WIV1: protein mirip lonjakan lebih dekat dengan mereka baik secara filogenetik maupun struktural - bahkan cocok dengan panjangnya, sementara protein Asam amino WIV1 / Rs3367 dan RsSHC014 13 lebih pendek dari trenggiling. Dan mutasi QTQTNS yang umum terjadi pada RaTG13 dan pangolin-19 (MP789) di wilayah situs protease tidak dapat meninggalkan spesialis yang acuh tak acuh.

Strain Yunnan lainnya

Ngomong-ngomong, peneliti lain pada tahun 2011 juga menemukan sampel virus corona dari Yunnan Rhinolophus affinis . Jenis LYRa11 yang menurut saya paling menarik:

Tetapi juga sangat jauh dari RaTG13, dan jauh lebih dekat dengan Rs3367 (ini adalah strain yang 96% bertepatan dengan SARS-CoV pertama):

Tetapi RaTG13, yang diisolasi dari kelelawar yang sama dari Rhinolophus affinis dengan LYRa11, terlihat paling tidak mirip dengan itu (ledakan kiri).

Dan akhirnya, jenis Yunnan lainnya (bernama Yunnan2011), diisolasi pada tahun 2011 dari subspesies lain dari ras tapal kuda, Rhinolophus pusillus , mirip dengan RaTG13 bahkan kurang dari LYRa11:

Ya, dan di antara mereka sendiri, Yunnan2011 dan LYRa11 (ledakan kanan di atas) tidak terlalu mirip, terlepas dari kawasan S2 yang sangat dilestarikan. Ngomong-ngomong, kekacauan macam apa yang mereka miliki dengan nama-nama strain? Pertama mereka meresepkannya sepanjang tahun, kadang-kadang sebagian, atau bahkan tidak sama sekali (Rs3367). Pertama adalah tipe pembawa ( Ra TG13), lalu kemudian (LY Ra 11). Masih bertanya-tanya apa arti TG, LY atau SHC? Inisial mendekripsi genom?

Baiklah, mari kita beralih dari arkeologi virus ke rekayasa virus, yaitu, transplantasi area utama protein lonjakan dan percobaan fungsi tambahan lainnya (GOF).

1999: Coronavirus Chimeric Pertama

Jika Anda berpikir bahwa semua mesin GOF ini dengan analisis apa yang sebenarnya memungkinkan coronavirus untuk berpindah dari satu spesies ke spesies lain dimulai sebagai respons terhadap epidemi SARS pertama pada tahun 2002, Anda salah. Ahli virologi bereksperimen dengan koronavirus chimeric jauh sebelum itu. Di sini, misalnya, adalah artikel sampel dari tahun 1999 dari kelompok Belanda Peter Rottier dari Utrecht dengan pepatah "Retargeting coronavirus dengan mengganti ectodomain dalam protein spike: melintasi penghalang spesies":

Dengan menggunakan rekombinasi RNA terarah, kami membuat mutan dari virus hepatitis coronavirus tikus (MHV), di mana ectodomain berbentuk tulang digantikan oleh ectodomain yang sangat berbeda dari protein virus peritonitis kucing yang menular. Virus chimeric yang dihasilkan, yang disebut fMHV, memperoleh kemampuan untuk menginfeksi sel-sel kucing dan pada saat yang sama kehilangan kemampuan untuk menginfeksi sel-sel tikus dalam kultur.
Sumber teks
Using targeted RNA recombination, we constructed a mutant of the coronavirus mouse hepatitis virus (MHV) in which the ectodomain of the spike glycoprotein (S) was replaced with the highly divergent ectodomain of the S protein of feline infectious peritonitis virus. The resulting chimeric virus, designated fMHV, acquired the ability to infect feline cells and simultaneously lost the ability to infect murine cells in tissue culture.

Omong-omong, Shi Zhengli tampaknya telah magang di bawah Peter Rottier di Utrecht. Setidaknya pada tahun 2005, ia adalah penulis bersama artikel bersama di mana Utrecht terdaftar sebagai afiliasinya (tetapi alamat saat ini sudah ditunjukkan di Institut Shanghai). Ngomong-ngomong, artikel itu sendiri juga sangat penasaran - di dalamnya penulis menyelidiki apa yang sebenarnya memungkinkan virus untuk memperluas tropisme spesies mereka:

Hanya sejumlah kecil mutasi pada protein seperti lonjakan yang memungkinkan coronavirus tikus untuk beralih dari tropisme terbatas-tikus ke kisaran inang yang diperluas dengan pasif secara in vitro. Salah satu virus yang kami pelajari mengakuisisi dua situs pengikat heparan sulfat putatif, sambil menjaga situs furin di tempat lain.
Sumber teks
Only a relatively few mutations in its spike protein allow the murine coronavirus to switch from a murine-restricted tropism to an extended host range by being passaged in vitro. One such virus that we studied had acquired two putative heparan sulfate-binding sites while preserving another site in the furin-cleavage motif.

Pertama, menarik bahwa situs furin dalam virus itu (SRRAHR | SV) mirip dengan situs di CoV2 (SPRRAR | SV), meskipun memotong lebih efisien dalam CoV2 karena dual arginin (ini menjadikannya situs polibasa , yaitu situs ia memiliki beberapa dasar asam amino berturut-turut di urutan RxxR ):

Tetapi artikel itu terutama ingin tahu bahwa mutasi yang memungkinkan virus untuk "memperluas cakrawala" bahkan tidak terjadi pada hewan laboratorium, tetapi secara in vitro ( dengan dilalui secara in vitro ). Dan, tampaknya, mereka terjadi cukup cepat:

MHV/pi23 — , 23 600 , MHV/BHK, HS- S1 , MHV/BHK, , HS- . MHV/pi23 , , MHV/BHK. HS- , , , S, HR1 (Fig. 1), . S, .
MHV/pi23, a virus obtained after 23 of the 600 passages that resulted in MHV/BHK, also contains a putative HS-binding site in the S1 domain at the same position as in MHV/BHK, albeit as a smaller insertion, while it lacks the putative HS-binding site immediately upstream of the fusion peptide. MHV/pi23 does infect nonmurine cells to some extent but much less efficiently than MHV/BHK. In addition to the multiple HS-binding sites, however, mutations found in other parts of the S protein, such as the HR1 domain and the putative fusion peptide (Fig. 1), might also contribute to the efficient entry into nonmurine cells. We are currently in the process of determining the S protein mutations that are required for the extended host range phenotype.

Ke depan, saya akan menyebutkan bahwa ada kelompok lain yang mencoba mutasi in vitro untuk meningkatkan virulensi virus corona, misalnya, MERS:

Untuk lebih memahami kemampuan beradaptasi spesies MERS-CoV, kami menggunakan varian DPP4 suboptimal untuk mempelajari adaptasi virus. Meninggalnya virus pada sel yang mengekspresikan varian DPP4 ini menghasilkan akumulasi mutasi pada protein lonjakan virus, yang meningkatkan replikasi.
Sumber teks
To better understand the species adaptability of MERS-CoV, we identified a suboptimal species-derived variant of DPP4 to study viral adaption. Passaging virus on cells expressing this DPP4 variant led to accumulation of mutations in the viral spike which increased replication.

Selain itu, mutasi mereka terjadi setelah beberapa bagian (putaran reproduksi kultur sel):

(F) Skema kemunculan mutasi tunggal dan ganda pada protein lonjakan MERS-CoV dalam bagian-bagian yang berbeda.
(G) Lokasi mutasi pada protein lonjakan MERS-CoV.
Sumber teks
(F) Schematic of single and double mutation emergence in MERS-CoV spike over different passages.
(G) Location of mutations within MERS-CoV spike.

Tetapi semua ini akan terjadi kemudian. Sementara itu, mari kita kembali ke 2002 - SEBELUM pecahnya SARS-CoV pertama.

Bagaimana Barik menyalakan jalan bagi semua orang

Ralph Barik adalah legenda dalam coronavirusology. Pelopor sejati dalam teknik manipulasi genom virus sintetis. Kembali pada tahun 2002, ia menerbitkan karya terobosan yang membuka tonggak baru dalam studi berbagai mekanisme virus alami dan dalam penelitian fungsi-fungsi (GOF). Dalam karya mereka , kelompok Barik secara sintetik menciptakan kembali tiruan dari coronavirus tikus alami:

II 59 (MHV-A59). , MHV 31,5 . , MHV-A59 ~ 31,5 ... , , , … , , .
Sumber teks
A novel method was developed to assemble a full-length infectious cDNA of the group II coronavirus mouse hepatitis virus strain A59 (MHV-A59). Seven contiguous cDNA clones that spanned the 31.5-kb MHV genome were isolated. The ends of the cDNAs were engineered with unique junctions and assembled with only the adjacent cDNA subclones, resulting in an intact MHV-A59 cDNA construct of ?31.5 kb in length. The interconnecting restriction site junctions that are located at the ends of each cDNA are systematically removed during the assembly of the complete full-length cDNA product, allowing reassembly without the introduction of nucleotide changes… The method has the potential to be used to construct viral, microbial, or eukaryotic genomes approaching several million base pairs in length and used to insert restriction sites at any given nucleotide in a microbial genome.

Artinya, para penulis, pada kenyataannya, menerjemahkan virus RNA ke dalam bahasa DNA (menggunakan reverse transcriptase), sehingga akan lebih mudah bagi mereka untuk memanipulasi genomnya menggunakan alat rekayasa genetika yang ada. Setelah membuat 7 segmen cDNA provirus seperti itu, penulis kemudian menjahitnya bersama-sama "mulus" (tanpa meninggalkan jejak), setelah itu mereka mentransfer konstruksi mereka kembali ke RNA, dari mana kemudian partikel virus terbentuk di sel lain.

SARS-2003

Hanya beberapa minggu setelah penerbitan karya kelompok Barik itu, epidemi SARS-CoV melanda , dan Ralph Barik tidak membuang waktu. Sudah di musim panas 2003, kelompoknya mengirim untuk mencetak karya tentang membuat klon sintetis SARS-CoV:

, , SARS-CoV Urbani SARS ( SARS-CoV), , . , , … SARS-CoV , .
Using a panel of contiguous cDNAs that span the entire genome, we have assembled a full-length cDNA of the SARS-CoV Urbani strain, and have rescued molecularly cloned SARS viruses (infectious clone SARS-CoV) that contained the expected marker mutations inserted into the component clones. Recombinant viruses replicated as efficiently as WT virus and both were inhibited by treatment with the cysteine proteinase inhibitor… Availability of a SARS-CoV full-length cDNA provides a template for manipulation of the viral genome, allowing for the rapid and rational development and testing of candidate vaccines and therapeutics against this important human pathogen.

Kecepatan kelompok Barik memungkinkan kita untuk memahami seberapa cepat tim ahli virologi yang berkualitas dapat membuat klon sintetis dari virus alami, dan karenanya membuat modifikasi genetik untuk itu. Dan itu pada tahun 2003. Hari ini semua laboratorium yang memenuhi syarat yang sama dapat diulang dalam hitungan minggu.

SARS-2006

Barik adalah yang pertama, tetapi jauh dari yang terakhir. Rekayasa genetika telah berkembang pesat, menciptakan lebih banyak alat baru. Kelompok lain mempraktikkan teknologi virologi sintetik alternatif. Sebagai contoh, pada tahun 2006, peneliti Spanyol mengulangi pencapaian Barik, juga menciptakan klon SARS sintetis , tetapi menggunakan teknologi lain ( kromosom bakteri buatan ):

Urbani SARS-CoV (BAC). . , Escherichia coli.
…
SARS-CoV E.coli DH10B 200 , ( ). .
The engineering of a full-length infectious cDNA clone and a functional replicon of the severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) Urbani strain as bacterial artificial chromosomes (BACs) is described in this study. In this system, the viral RNA was expressed in the cell nucleus under the control of the cytomegalovirus promoter and further amplified in the cytoplasm by the viral replicase. Both the infectious clone and the replicon were fully stable in Escherichia coli.
…
The assembled SARS-CoV infectious cDNA clone was fully stable during its propagation in E. coli DH10B cells for more than 200 generations, considerably facilitating the genetic manipulation of the viral genome (data not shown). The detailed cloning strategy, plasmid maps, and sequences are available upon request.

Benar, mereka tidak melakukannya dengan elegan seperti Barik, karena dalam perakitan akhir virus sintetis mereka masih menambahkan situs enzim restriksi, sementara Barik belajar menggabungkan fragmen “dengan mulus”. Tetapi ini adalah hal-hal sepele, pendekatan orang Spanyol juga cukup berhasil - pada tahun 2013, dengan bantuan mereka, mereka menciptakan klon sintetis MERS-a , dan pada tahun 2015, teknik mereka dimasukkan ke dalam buku panduan teks coronavirus (bab 13):

Wuhan 2007

Tetapi kembali pada tahun 2007. Kemudian, kelompok Shi Zhengli bergabung dengan ras virologi sintetik dengan studi protein mirip lonjakan manusia dan koronavirus kelelawar, mencoba menentukan apa yang sebenarnya bertanggung jawab atas kemampuan untuk melompat dari satu spesies ke spesies:

Sejumlah protein lonjakan chimeric telah dibangun dengan memasukkan berbagai sekuens protein lonjakan SARS-CoV ke dalam tulang punggung protein SL-CoV.
Sumber teks
A series of S chimeras was constructed by inserting different sequences of the SARS-CoV S into the SL-CoV S backbone.

Artinya, penulis memasukkan segmen berbeda dari protein SARS-CoV manusia ke dalam protein virus kelelawar. Inilah kesimpulan mereka:

Dari hasil ini, ditemukan bahwa wilayah 310-518 dalam protein lonjakan BJ01 diperlukan dan cukup untuk mendapatkan protein lonjakan Rp3 kemampuan mengikat pada ACE2 manusia.
Sumber teks
From these results, it was deduced that the region from aa 310 to 518 of BJ01-S was necessary and sufficient to convert Rp3-S into a huACE2-binding molecule.

Pada saat yang sama, mereka mencoba mengganti fragmen yang lebih pendek, termasuk hanya RBM:

Untuk memasukkan RBM dari SARS-CoV ke dalam protein lonjakan SL-CoV, daerah pengkodean 424 menjadi 494 asam amino dalam protein lonjakan BJ01 digunakan untuk menggantikan daerah terkait dalam protein Rp3, menghasilkan gen protein lonjakan chimeric (CS), yang ditunjuk sebagai CS424 –494.
Sumber teks
For introduction of the RBM of SARS-CoV S into the SL-CoV S, the coding region from aa 424 to 494 of BJ01-S was used to replace the corresponding regions of Rp3-S, resulting in a chimeric S (CS) gene designated CS424–494.

Mengingat bahwa itu ditulis pada tahun 2007, saya pikir hari ini tidak akan sulit bagi bahkan ahli virus pemula untuk mengganti RBM dari satu virus dengan yang lain.

Chimera 2015

Berdasarkan percobaan di atas, tidak terlalu jelas apa yang sebenarnya menyebabkan sensasi yang dihasilkan oleh publikasi fungsi yang mungkin paling sensasional. Ini, tentu saja, adalah tentang kerja bersama Shi Zhengli dan Ralph Barik, di mana mereka menciptakan virus chimeric sintetis:

SARS-CoV, , SHC014 SARS-CoV. , 2b, SHC014 , SARS (ACE2), in vitro, SARS-CoV. , in vivo . ; , CoV . SHC014 in vitro, in vivo.
Sumber teks
Using the SARS-CoV reverse genetics system, we generated and characterized a chimeric virus expressing the spike of bat coronavirus SHC014 in a mouse-adapted SARS-CoV backbone. The results indicate that group 2b viruses encoding the SHC014 spike in a wild-type backbone can efficiently use multiple orthologs of the SARS receptor human angiotensin converting enzyme II (ACE2), replicate efficiently in primary human airway cells and achieve in vitro titers equivalent to epidemic strains of SARS-CoV. Additionally, in vivo experiments demonstrate replication of the chimeric virus in mouse lung with notable pathogenesis. Evaluation of available SARS-based immune-therapeutic and prophylactic modalities revealed poor efficacy; both monoclonal antibody and vaccine approaches failed to neutralize and protect from infection with CoVs using the novel spike protein. On the basis of these findings, we synthetically re-derived an infectious full-length SHC014 recombinant virus and demonstrate robust viral replication both in vitro and in vivo.

Faktanya, para peneliti sudah berada di jalur yang terpukul: mereka mengambil protein seperti lonjakan dari RsSHC014, yang diisolasi Shi Zhengli dari kelelawar Yunnan pada tahun 2011, dan memasukkannya ke dalam SARS-CoV, khusus disesuaikan untuk merangkak tikus, untuk percobaan in vivo berikutnya. pada tikus ini. Nah, pada sel manusia, desain baru diuji. Dan pada saat yang sama kami berlatih membuat klon rekombinan dari RsSHC014 yang sama - yah, mengapa tidak? Bagaimanapun, pertama, itu indah:

(a) Skema klon molekuler SHC014-CoV, yang disintesis dalam bentuk enam segmen cDNA yang berdekatan (ditunjuk sebagai SHC014A, SHC014B, SHC014D, SHC014D, SHC014E dan SHC014F) diapit oleh situs enzim restriksi BglI unik yang menyediakan perakitan untuk DNA 1a, 1b, spike, 3, amplop, matriks, 6-8 dan nukleokapsid). Nukleotida yang digarisbawahi adalah sekuens yang menonjol yang terbentuk setelah pencernaan enzim restriksi.
Sumber teks
(a) Schematic of the SHC014-CoV molecular clone, which was synthesized as six contiguous cDNAs (designated SHC014A, SHC014B, SHC014C, SHC014D, SHC014E and SHC014F) flanked by unique BglI sites that allowed for directed assembly of the full-length cDNA expressing open reading frames (for 1a, 1b, spike, 3, envelope, matrix, 6–8 and nucleocapsid). Underlined nucleotides represent the overhang sequences formed after restriction enzyme cleavage.

Dan kedua, para peneliti menyadari bahwa bukan hanya karena sifat protein seperti lonjakan ke reseptor bahwa potensi virus untuk transisi dari satu spesies hewan ke spesies lain ditentukan karena chimera SHC014-MA15 lebih ganas daripada SHC014 itu sendiri, bahkan dalam sel manusia:

Patut dicatat bahwa perbedaan tropisme di paru-paru dibandingkan dengan SARS-MA15 dan melemahnya SHC014-CoV dalam kultur [saluran udara epitel manusia] relatif terhadap SARS-CoV Urbani menunjukkan bahwa selain mengikat ACE2, faktor-faktor lain - termasuk prosesivitas protein lonjakan , ketersediaan hayati dari reseptor atau antagonisme dari respon imun inang - dapat berkontribusi pada virulensi.
Sumber teks
Notably, differential tropism in the lung as compared to that with SARS-MA15 and attenuation of full-length SHC014-CoV in [human epithelial airway cell] cultures relative to SARS-CoV Urbani suggest that factors beyond ACE2 binding — including spike processivity, receptor bio-availability or antagonism of the host immune responses — may contribute to emergence.

Saya terutama ingin menyoroti prosesitas protein lonjakan dalam kutipan, karena ini bukan pertama kalinya bahwa para peneliti telah menulis bahwa kemampuan protein lonjakan untuk membelah protease (termasuk furin) memiliki efek signifikan pada virulensi.

Kesimpulannya, temanya adalah foto bersama Ralph Barik dan Shi Zhengli. Foto diambil di Wuhan, pada Oktober 2018:

Mouse SARS-2007

Di sini saya tidak bisa membantu tetapi menyebutkan "MA15 virus" jenis apa yang ada di karya sebelumnya. Ini sama sekali bukan semacam coronavirus mouse alami, seperti yang mungkin disarankan. Dan ini adalah manusia SARS-CoV yang dimodifikasi laboratorium, yang pada 2007, kelompok Barik yang sama - yang tampaknya bersaing dengan kelompok Shi Zhengli (ingat artikel mereka dari tahun 2007) - berubah menjadi pembunuh sejati . Untuk melakukan ini, pertama-tama mereka secara iteratif “meningkatkan” pada tikus, dan ketika setelah beberapa kali iterasi menjadi “efektif” secara maksimal, mereka mereproduksi mutasi yang muncul pada tikus dalam klon sintetik dari virus baru, dan sekali lagi memeriksa apakah itu benar-benar meningkatkan infektivitas:

SARS-CoV ( Urbani) BALB/c. (MA15), . , , , . , . , , 15, , . MA15 , ; SARS-CoV (rMA15), MA15. 15 , SARS .
We adapted the SARS-CoV (Urbani strain) by serial passage in the respiratory tract of young BALB/c mice. Fifteen passages resulted in a virus (MA15) that is lethal for mice following intranasal inoculation. Lethality is preceded by rapid and high titer viral replication in lungs, viremia, and dissemination of virus to extrapulmonary sites accompanied by lymphopenia, neutrophilia, and pathological changes in the lungs. Abundant viral antigen is extensively distributed in bronchial epithelial cells and alveolar pneumocytes, and necrotic cellular debris is present in airways and alveoli, with only mild and focal pneumonitis. These observations suggest that mice infected with MA15 die from an overwhelming viral infection with extensive, virally mediated destruction of pneumocytes and ciliated epithelial cells. The MA15 virus has six coding mutations associated with adaptation and increased virulence; when introduced into a recombinant SARS-CoV, these mutations result in a highly virulent and lethal virus (rMA15), duplicating the phenotype of the biologically derived MA15 virus. Intranasal inoculation with MA15 reproduces many aspects of disease seen in severe human cases of SARS.

-2008

Berbicara tentang persaingan Barik dan Shi Zhengli. Sejalan dengan transplantasi RBD dari manusia SARS-CoV ke murine, kelompoknya menciptakan chimera yang sama dengan strain kelelawar. Pada 2008, kelompok Barik mengambil strain Bat-SCoV dan menggantinya dengan RBD dalam protein lonjakan dengan RBD dari manusia SARS. Faktanya, dia mengulangi pekerjaan Shi Zhengli dari 2007, tidak hanya membatasi dirinya pada pseudo-virus, tetapi juga menciptakan coronavirus chimeric yang nyata - bukan hanya virus murine seperti pada karya 2015, tetapi juga yang paling manusiawi. Para penulis jelas bangga dengan prestasi mereka:

, 29,7 — (Bat-SCoV), (SARS), SARS-CoV.
…
, RBDs Bat-SCoV SARS-CoV , RBD Bat-SCoV ( 323–505) RBD SARS-CoV ( 319–518) (27, 28) (GenBank FJ211860), , in vivo (Fig. 1B).
Here, we report the design, synthesis, and recovery of the largest synthetic replicating life form, a 29.7-kb bat severe acute respiratory syndrome (SARS)-like coronavirus (Bat-SCoV), a likely progenitor to the SARS-CoV epidemic.
…
To test whether the RBDs of Bat-SCoV and SARS-CoV were interchangeable, we replaced the Bat-SCoV RBD (amino acid 323–505) with the SARS-CoV RBD (amino acid 319–518) (27, 28) (GenBank accession no. FJ211860), simulating a theoretical recombination event that might occur during mixed infection in vivo (Fig. 1B).

(B) , SARS-CoV Bat-SCoV. . Bat-SRBD Bat-SCoV, , RBD Bat-SCoV ( Bat-SCoV 323–505) RBD SARS-CoV ( 319–518) ( GenBank FJ211860 ). Bat-SRBD-MA RBD MA15 SARS-CoV Y436H. Bat-SRBM 13 SARS-CoV, ACE2, RBD 323I-429T Bat-SCoV 426R-518D SARS-CoV. Bat-Hinge Bat-SRBM, Bat-SCoV 392L-397E SARS-CoV 388V-393D. Bat-F 1–24057 SARS-CoV ( 855 ) 3'- Bat-SCoV. 1- (P1). ND , .
Sumber teks
(B) Schematic representation showing organization of the SARS-CoV and Bat-SCoV Spike proteins. The engineered Spike proteins are pictured below with the virus name to the left. Bat-SRBD includes all of the Bat-SCoV Spike sequence except that the Bat-SCoV RBD (Bat-SCoV amino acid 323–505) is replaced with the SARS-CoV RBD (amino acid 319–518) (GenBank accession no. FJ211860). Bat-SRBD-MA includes the MA15 Spike RBD change at SARS-CoV aa Y436H. Bat-SRBM includes the minimal 13 SARS-CoV residues critical for ACE2 contact, resulting in a chimeric RBD of Bat-SCoV amino acid 323I-429T and SARS-CoV amino acid 426R-518D. Bat-Hinge is Bat-SRBM sequence, with Bat-SCoV amino acid 392L-397E replaced with SARS-CoV amino acid 388V-393D. Bat-F includes nt 1–24057 of SARS-CoV (to Spike amino acid 855), with the remaining 3? sequence from Bat-SCoV. To the right of the schematic representations, observation of transcript activity and approximate stock titers at passage 1 (P1) are indicated. ND indicates no infectious virus detected by plaque assay.

Barik 2016

Dalam karya Barik secara umum ada banyak remake. Sebagai contoh, pada tahun 2016, tahun dimana ia hampir mengulangi pekerjaan yang sama dengan Shi Chzhenli pada tahun 2015 untuk membuat virus chimeric, tetapi kali ini ia memasukkan protein spinous myshinoadaptirovanny SARS yang bukan dari RsSCH014, dan dari yang lain ditemukan Shi Chzhenli di Yunnan . kerabat dekat - Rs3367. Atau, tepatnya, dari strain WIV1, klon laboratorium Rs3367 yang tumbuh dalam kultur sel di Institut Virologi Wuhan pada 2013. Inilah yang dilakukan grup Barik di tahun 2016:

SARS-CoV (7), WIV1-CoV, , , , (. S1A). WIV1-CoV, SARS WIV1 (WIV1-MA15, . S1B). … Vero SARS-CoV Urbani, WIV1-MA15 WIV1-CoV.
Using the SARS-CoV infectious clone as a template (7), we designed and synthesized a full-length infectious clone of WIV1-CoV consisting of six plasmids that could be enzymatically cut, ligated together, and electroporated into cells to rescue replication competent progeny virions (Fig. S1A). In addition to the full-length clone, we also produced WIV1-CoV chimeric virus that replaced the SARS spike with the WIV1 spike within the mouse-adapted backbone (WIV1-MA15, Fig. S1B). … To confirm growth kinetics and replication, Vero cells were infected with SARS-CoV Urbani, WIV1-MA15, and WIV1-CoV.

Pada umumnya, pada tahun 2016, Barik mengkloning artikelnya dari tahun 2015. Selain itu, maknanya tidak terlalu jelas bagi saya: lagipula, WIV1 / Rs3367, jika Anda ingat, sudah 96% bertepatan dengan SARS-CoV (untuk ini Shi Zhengli memperoleh ketenaran). Oleh karena itu, mengapa tidak terlalu jelas bagi saya untuk memasukkan protein seperti lonjakan dari kerabat terdekatnya kembali ke SARS-CoV. Mungkin hanya karena cinta seni. Dalam hal ini, judul artikelnya mendapatkan dualitas tertentu: "WIV1-CoV seperti SARS siap untuk transisi ke manusia" . Untuk beberapa alasan, bingkai ini langsung terlintas dalam pikiran:

Saya masih tidak mengerti bagaimana pada tahun 2015 Barik berhasil mendapatkan paten untuk pembuatan "protein chikeic coronavirus spike-like", dengan mempertimbangkan fakta bahwa ia dan Shi Zhengli menerbitkan semua ini jauh sebelum 2015.

Barik 1990

Oke, sentuhan terakhir pada potret Ralph Barik. Dia bukan hanya orang tua di bidang ini, tetapi juga terlibat dalam desain virus corona rekombinan bahkan sebelum sequencer dan alat rekayasa genetika modern lainnya. Inilah artikelnya tentang penciptaan "mutan suhu" dari coronavirus tikus dari tahun 1990:

Sepanjang penelitian ini, virus tikus hepatitis strain A59 (MHV-A59) digunakan. Virus ini diperbanyak dan dikloning tiga kali dalam garis sel astrositoma tikus kontinu (DBT).
...
Berbagai kombinasi mutan yang peka terhadap suhu dicampur dan diinokulasi ke dalam sel dengan multiplikasi infeksi sama dengan 10.
Sumber teks
The A59 strain of mouse hepatitis virus (MHV-A59) was used throughout the course of this study. Virus was propagated and cloned three times in the continuous murine astrocytoma cell line (DBT).
…
Various combinations of ts mutants were mixed and inoculated onto cells at a multiplicity of infection of 10 each.

Jadi Barik telah menciptakan berbagai mutan virus selama lebih dari 30 tahun.

Barik 2019

Dan, omong-omong, bahkan sekarang, langkahnya tidak berkurang. Pada akhir Oktober 2019, kelompoknya mengajukan publikasi artikel lain tentang peran penting dari situs furin dalam protein lonjakan untuk mengatasi "penghalang infeksi zoonosis" oleh coronavirus:

Bersama-sama, hasil ini menunjukkan bahwa pembelahan protease juga merupakan penghalang utama untuk infeksi sel Vero dengan HKU5-CoV. Melihat lebih jauh, kami membandingkan belahan dada yang diprediksi di perbatasan S1 / S2, S2 dan situs sosin protease endosomal dalam MERS, PDF2180, dan protein seperti lonjakan HKU5 (Gbr. 6D) (26). Di situs S1 / S2, MERS, Uganda, dan HKU5 mempertahankan situs pembelahan RXXR, meskipun berbagai asam amino internal dapat memengaruhi efektivitasnya. Untuk urutan S2, MERS dan HKU5 juga mempertahankan motif RXXR; Namun, arginin pertama (SNAR) tidak ada di paku strain Uganda, yang berpotensi mempengaruhi pembelahannya.
Sumber teks
Together, these results demonstrate that protease cleavage is also the primary barrier to infection of Vero cells with HKU5-CoV. Examining further, we compared the predicted cleavage at S1/S2 border, S2’, and the endosomal cysteine protease site across MERS, PDF2180, and HKU5 spikes (Fig. 6D) (26). For the S1/S2 site, MERS, Uganda, and HKU5 maintain the RXXR cleavage motif, although the different interior amino acids may alter efficiency. For the S2’ sequence, MERS and HKU5 also retain the RXXR motif; however, the Uganda spike lacks the first arginine (SNAR), potentially impacting cleavage.

Mengingat semangat persaingan antara kelompok Barik dan Shi Zhengli, saya bertanya-tanya apa kemungkinan bahwa di Wuhan pada akhir 2019 seseorang juga melakukan penelitian serupa?

Keuntungan-dari-Fungsi: "Deny tidak dapat melanjutkan"

Banyak yang pertama kali mendengar tentang studi di atas mengajukan pertanyaan yang masuk akal: "Apa-apaan ini?" Mengapa para ilmuwan membuat virus pembunuh chimeric? Jawaban yang benar secara politis: untuk mengembangkan perlindungan pencegahan (vaksin dan obat-obatan) dari kemungkinan chimera alami dan untuk memahami risiko terjadinya mereka. Di sini, pada kenyataannya, bahwa Barik dan Shi Zhengli dan rekan penulisnya sendiri menulis tentang hal ini dalam artikel yang sama tahun 2015:

, (GOF). (Fig. 4a, b) , SHC014-MA15, , . SHC014-MA15 SARS-CoV, , CoV Urbani MA15, , . , Urbani-MA15 CoV, SHC014-MA15 (. 1). , , , . , . GOF; . , , , .
Sumber teks
In addition to offering preparation against future emerging viruses, this approach must be considered in the context of the US government–mandated pause on gain-of-function (GOF) studies. On the basis of previous models of emergence (Fig. 4a,b), the creation of chimeric viruses such as SHC014-MA15 was not expected to increase pathogenicity. Although SHC014-MA15 is attenuated relative to its parental mouse-adapted SARS-CoV, similar studies examining the pathogenicity of CoVs with the wild-type Urbani spike within the MA15 backbone showed no weight loss in mice and reduced viral replication. Thus, relative to the Urbani spike–MA15 CoV, SHC014-MA15 shows a gain in pathogenesis (Fig. 1). On the basis of these findings, scientific review panels may deem similar studies building chimeric viruses based on circulating strains too risky to pursue, as increased pathogenicity in mammalian models cannot be excluded. Coupled with restrictions on mouse-adapted strains and the development of monoclonal antibodies using escape mutants, research into CoV emergence and therapeutic efficacy may be severely limited moving forward. Together, these data and restrictions represent a crossroads of GOF research concerns; the potential to prepare for and mitigate future outbreaks must be weighed against the risk of creating more dangerous pathogens. In developing policies moving forward, it is important to consider the value of the data generated by these studies and whether these types of chimeric virus studies warrant further investigation versus the inherent risks involved.

Apakah kata-kata ini profetik? Pada akhir 2014, Amerika Serikat memberlakukan moratorium pembiayaan negara untuk studi peningkatan fungsi tersebut, tetapi segera dibatalkan (pada 2017) . Dan di Cina, tidak ada moratorium studi semacam itu diperkenalkan, dan sebaliknya, mereka membuka "laboratorium super (tanpa) berbahaya" baru tingkat BSL-4, seperti pada 2017 di Wuhan :

Untuk berjaga-jaga, saya akan menjelaskan bahwa hingga 2017, laboratorium di Institut Virologi Wuhan adalah BSL-3, yang cukup untuk bekerja dengan coronavirus. Berikut adalah beberapa kutipan dari catatan di atas tentang pembuatan laboratorium Wuhan BSL-4:

— , , BSL-4, . ; , . « ».
…
. BSL-4 ; , , , .

, , BSL-4 — , , — . « , , », — .

BSL-4 . , , , , . , , .

« », — . , : « , , ».

Trevan mengatakan investasi Cina di laboratorium BSL-4 dapat, di atas segalanya, menjadi cara untuk membuktikan kepada dunia bahwa negara itu kompetitif. "Ini adalah simbol status besar dalam biologi," katanya, "terlepas dari apakah itu diperlukan atau tidak."
Sumber teks
Future plans include studying the pathogen that causes SARS, which also doesn’t require a BSL-4 lab, before moving on to Ebola and the West African Lassa virus, which do. Some one million Chinese people work in Africa; the country needs to be ready for any eventuality, says Yuan. “Viruses don’t know borders.”
…
The plan to expand into a network heightens such concerns. One BSL-4 lab in Harbin is already awaiting accreditation; the next two are expected to be in Beijing and Kunming, the latter focused on using monkey models to study disease.
Lina says that China’s size justifies this scale, and that the opportunity to combine BSL-4 research with an abundance of research monkeys — Chinese researchers face less red tape than those in the West when it comes to research on primates — could be powerful. “If you want to test vaccines or antivirals, you need a non-human primate model,” says Lina.
But Ebright is not convinced of the need for more than one BSL-4 lab in mainland China. He suspects that the expansion there is a reaction to the networks in the United States and Europe, which he says are also unwarranted. He adds that governments will assume that such excess capacity is for the potential development of bioweapons.
“These facilities are inherently dual use,” he says. The prospect of ramping up opportunities to inject monkeys with pathogens also worries, rather than excites, him: “They can run, they can scratch, they can bite.”
Trevan says China’s investment in a BSL-4 lab may, above all, be a way to prove to the world that the nation is competitive. “It is a big status symbol in biology,” he says, “whether it’s a need or not.”

Menariknya, selain Wuhan, mereka berencana untuk membuka laboratorium BSL-4 baru di Kunming, dengan tujuan untuk menguji vaksin pada primata. Kunming, saya ingatkan Anda, ini adalah ibu kota Yunnan. Di gua-gua terdekatlah Shi Zhengli menemukan alunan Rs3367 dan RsSHC014. Ngomong-ngomong, pengujian keutamaan disebut sebagai langkah lebih lanjut yang mungkin untuk pengembangan vaksin pencegahan terhadap kemungkinan wabah coronavirus di masa depan dalam "sama" (berapa kali saya menyebutnya demikian?) Artikel oleh Barik dan Shi Zhengli:

Namun, pengujian lebih lanjut pada primata bukan manusia diperlukan untuk menerjemahkan temuan ini menjadi potensi patogen pada manusia. Penting untuk dicatat bahwa kurangnya agen terapeutik yang tersedia menentukan kebutuhan kritis untuk studi lebih lanjut dan pengembangan metode pengobatan. Dengan pengetahuan ini, program pengawasan, pereaksi diagnostik, dan perawatan yang efektif dapat dikembangkan yang dapat melindungi terhadap munculnya coronavirus spesifik kelompok 2b, seperti SHC014, dan dapat diterapkan pada cabang coronavirus lain yang mendukung kelompok heterogen serupa.
Sumber teks
However, further testing in nonhuman primates is required to translate these finding into pathogenic potential in humans. Importantly, the failure of available therapeutics defines a critical need for further study and for the development of treatments. With this knowledge, surveillance programs, diagnostic reagents and effective treatments can be produced that are protective against the emergence of group 2b–specific CoVs, such as SHC014, and these can be applied to other CoV branches that maintain similarly heterogeneous pools.

Ada kemungkinan bahwa pada tahun 2019 pembuatan dan pengujian vaksin potensial dari berbagai coronavirus seperti SARS sudah berjalan lancar.

Tentang berapa banyak epidemi ajaib yang disiapkan roh pencerahan ...

Kalau begitu, mari kita lihat versi kebocoran lab. Untuk mulai dengan, saya akan memberikan latar belakang sejarah singkat tentang kebocoran lainnya. Karena pucuk virus dari laboratorium di masa lalu terjadi lebih dari satu kali. Pertama-tama, dari SARS-CoV yang sama: untuk pertama kalinya ia melarikan diri pada musim panas 2003 di Singapura, kemudian pada Desember 2003 di Taiwan, dan pada musim semi 2004 ia dua kali terbang ke Beijing.

Ada telepon yang mengkhawatirkan di Eropa dan AS, meskipun tidak ada infeksi di sana. Misalnya, di Prancis, sebuah laboratorium entah bagaimana kehilangan tabung reaksi dengan SARS , dan di laboratorium USA BSL-4 di Texas, tabung reaksi dengan virus demam berdarah Venezuela hilang :

Hanya satu ilmuwan yang bekerja dengan virus itu, dan Reyes mengatakan lab mencurigai ilmuwan itu secara tidak sengaja melemparkan tabung reaksi pada bulan November.
...
The Galveston Biolaboratory memiliki langkah-langkah keamanan paling ketat karena sedang mempelajari bahan keamanan hayati BSL-4, yaitu penyakit menular berbahaya yang tidak memiliki vaksin atau obat-obatan. Bahan BSL-4 termasuk Guanarito, Ebola, dan cacar.
Sumber teks
Only one scientist worked with the virus, and Reyes said the lab suspects that scientist accidentally threw the vial away in November.
…
Galveston biolab requires the most stringent safety measures because it studies biosafetly level BSL-4 materials, or dangerous infectious diseases that have no vaccines or cures. BSL-4 materials include Guanarito, Ebola and smallpox.

Sejarah tahu yang lain, kebocoran skala jauh lebih besar . Misalnya, "kebangkitan" virus flu H1N1 pada tahun 1977, yang sebelumnya dianggap telah menghilang. Ya, ini adalah virus dari "wanita Spanyol" yang sama:

H1N1 1918 , ( 1947 ), 1957 «» H2N2, . H1N1, -, , 20 . 1969 H3N2 H2N2 .

1977 . H1N1 , 1978 . , 1977 . H1N1 - , , . , , , H1N1 1977 H1N1, 1949–1950 , , .
…
2009–2010 . , H1N1 1977 : « — A H1N1, 1977 ».
…
, 1977 . H1N1, , « » (Kung 1978). , , , 1970- ( ) . .

, , 1977–78 . - , , -, H1N1 1978 . H1N1, , . 1976–77 20 H1N1 1957, . 1977 , .
Human influenza H1N1 viruses appeared with the 1918 pandemic, and persisted, slowing accumulating small changes in its genome (with a major change in 1947), until the H2N2 “Asian” flu appeared in 1957, causing a worldwide pandemic. H1N1 influenza virus then apparently became extinct, and was not isolated for 20 years. In 1969 the “Hong Kong” H3N2 virus replaced the H2N2 virus, and is still circulating.
In September 1977 an H1N1 influenza virus was isolated from human infections in the Far East region of the Soviet Union, and in early 1978 the Chinese reported they had isolated H1N1 virus in May of 1977 in northeast China adjacent to the Soviet outbreak. Using the early genetic tools available at the time, the 1977 H1N1 virus was found to be closely related to H1N1 human influenza viruses circulating in 1949–1950, but not to those circulating earlier or later.
…
Only since 2009–2010 did major papers begin to state directly the 1977 emergence of H1N1 influenza was a laboratory related release: “The most famous case of a released laboratory strain is the re-emergent H1N1 influenza A virus which was first observed in China in May of 1977 and in Russia shortly thereafter.”
…
The speculation that the 1977 release may have been related to H1N1 vaccine research is supported by the observation that in the initial outbreaks in China, nine of the ten viral isolates expressed “temperature sensitivity” (Kung 1978). Temperature sensitivity normally an uncommon trait, but one that was in the 1970s (and still is) a fundamental trait for making live attenuated influenza vaccines. Temperature sensitivity generally occurs only after a series of substantial laboratory manipulations and selections.
Interestingly, further investigation indicated the circulating strains in 1977–78 were often comprised of mixed temperature-sensitive and normal components, and that temperature sensitivity apparently disappeared from the post-1978 H1N1 lineage rapidly. Escape of a mid-protocol population of H1N1 virus undergoing laboratory selection for temperature sensitive mutants would provide such a mixed population. In 1976–77 laboratory personnel in their late teens or early 20s would not have been exposed to pre-1957 H1N1 influenza viruses, and been susceptible to laboratory infections. The low severity of the 1977 pandemic might be in part due to the temperature sensitivity of the virus, a trait that limits virus replication in pulmonary tissues.

Tampaknya penciptaan mutan virus yang peka terhadap suhu untuk mengembangkan vaksin “dilemahkan” potensial tersebar luas pada akhir abad kedua puluh. Jika Anda ingat, pada tahun 1990, Barik juga bereksperimen dengan menciptakan strain yang sensitif terhadap suhu.

Bisakah sesuatu seperti ini menyebabkan pandemi coronavirus tahun 2019? Kenapa tidak? Berikut beberapa opsi yang mungkin - dari mengembangkan vaksin potensial hingga hanya penelitian tentang rekombinasi laboratorium virus kelelawar dan trenggiling. Beberapa peneliti yang sangat ambisius bahkan dapat memutuskan inisiatif pribadi untuk menggabungkan dua "tema mode" - menambahkan situs furin dan mentransplantasikan RBM dari strain satu spesies (pangolin) ke yang lain (kelelawar), sehingga nantinya, mengkonfirmasi peningkatan virulensi desain chimeric baru, untuk merilis artikel tangguh lainnya tentang bahaya yang menunggu umat manusia di gua-gua Yunnan atau di pasar basah. Dan jika vaksin melawan jenis yang berbahaya dapat dibuat secara preventif, maka kehormatan dan rasa hormat untuk peneliti semacam itu akan dijamin.

Apakah saya menegaskan bahwa memang seperti itu? Tentu saja tidak. Karena hari ini tidak ada bukti skenario seperti itu. Hanya ada serangkaian kebetulan aneh - misalnya, bahwa wabah virus corona Yunnan terjadi ribuan kilometer dari Yunnan tepatnya di pasar yang paling dekat dengan Institut Virologi Wuhan. Atau mungkin tidak ada di pasaran, karena dari 4 pasien sakit pertama, tiga tidak ada di pasaran . Nah, kebetulan dalam fitur struktural genom virus, yang menyerupai manipulasi yang telah dilakukan virologis berulang kali dengan virus semacam itu di laboratorium. Tapi kebetulan bukan bukti.

Selain itu, kebetulan terjadi, dan tentu saja ketegangan semacam itu juga bisa muncul di alam. Belum jelas bagaimana tepatnya - untuk ini, kelelawar dan strain pangolinium harus bertemu dalam satu sel (sel tubuh seseorang, bukan sel logam), dan di Wuhan, karena wabah terjadi di sana (jika tidak kita akan melihat fokus lain Covid oleh jalur ternak pertama ke Wuhan). Mengingat bahwa kelelawar tidak dijual di pasar Wuhan , dan umumnya berhibernasi pada saat ini tahun ini, opsi ini masih merupakan misteri yang belum terpecahkan.

Ngomong-ngomong, baru-baru ini ada berita bahwa pada tahun 2018, para ahli Amerika melakukan pemeriksaan terhadap Institut Wuhan oleh para ahli virologi, dan bahkan berbicara dengan Shi Zhengli. Hasil dari "tur" mereka adalah dua telegram diplomatik ke Washington, di mana mereka mencatat sejumlah kelemahan dalam memastikan keamanan laboratorium:

Sumber-sumber Telegram mengatakan mereka seharusnya meningkatkan kekhawatiran tentang masalah keamanan yang serius di lab WIV, terutama mengenai kerjanya dengan koronavirus kelelawar. Pejabat Kedutaan menyerukan Amerika Serikat untuk lebih memperhatikan laboratorium ini dan memberikan dukungan tambahan.
...
« WIV , , », — 19 2018 , , , WIV. ( .)
Peneliti Cina di WIV menerima bantuan dari Laboratorium Nasional Galveston di Departemen Medis Universitas Texas dan organisasi lain di Amerika Serikat, tetapi orang Cina meminta bantuan tambahan. Telegrams berpendapat bahwa Amerika Serikat harus memberikan dukungan lebih lanjut ke laboratorium Wuhan, terutama karena studi mereka tentang coronavirus kelelawar itu penting, tetapi juga berbahaya.
Sumber teks
Sources familiar with the cables said they were meant to sound an alarm about the grave safety concerns at the WIV lab, especially regarding its work with bat coronaviruses. The embassy officials were calling for more U.S. attention to this lab and more support for it, to help it fix its problems.
…
“During interactions with scientists at the WIV laboratory, they noted the new lab has a serious shortage of appropriately trained technicians and investigators needed to safely operate this high-containment laboratory,” states the Jan. 19, 2018, cable, which was drafted by two officials from the embassy’s environment, science and health sections who met with the WIV scientists. (The State Department declined to comment on this and other details of the story.)
The Chinese researchers at WIV were receiving assistance from the Galveston National Laboratory at the University of Texas Medical Branch and other U.S. organizations, but the Chinese requested additional help. The cables argued that the United States should give the Wuhan lab further support, mainly because its research on bat coronaviruses was important but also dangerous.

Sangat lucu bahwa laboratorium Texas di Galveston, yang pada suatu waktu sendiri telah kehilangan tabung percobaan dengan virus Venezuela , membantu orang-orang Wuhan . Selain itu, dia membantu tidak hanya dengan kata-kata, spesialis Wuhan melakukan pelatihan di sana, yang bahkan ditulis oleh Bulletin Wuhan (meskipun, sekarang publikasi telah dihapus dari situs, tetapi masih tersedia di arsip web ):

Sentuhan terakhir terhadap potret keluarga dari kebocoran laboratorium: pada November 2019, wabah brucellosis (infeksi bakteri) terjadi di dua pusat penelitian di Lanzhou , yang memengaruhi lebih dari 100 peneliti yang bekerja di sana.

Kemungkinan bekas buatan manusia

Kemudian tinggalkan ahli virologi dan balikkan mata kita pada virus itu sendiri. Adakah tanda-tanda kegilaan manusia di dalamnya? Pertama, beberapa kata tentang apa artinya "eksplisit". Jelas bahwa secara alami setiap mutasi dapat terjadi sepenuhnya secara kebetulan. Bahkan jika ikatan yang menciptakan situs furin di CoV2 bukan "PRRA", tetapi "MADEINWVHANPRRA", masih ada peluang tidak nol yang dapat muncul secara kebetulan. Tetapi bagi kami, dan untuk pengadilan mana pun, saya pikir ini akan cukup untuk membuktikan asal buatan manusia tanpa keraguan .

Masalah utama dengan bukti tersebut adalah bahwa bahkan dalam virus buatan manusia mereka mungkin tidak ada. Secara kasar, seorang insinyur genetika yang baik dapat membuat virus sintetis "identik dengan alami". Selain itu, sering kali para peneliti dengan sengaja memperkenalkan mutasi sinonim ke dalam struktur mereka sehingga strain mereka dan yang alami dapat dibedakan kemudian. Tetapi jika pencipta virus tidak mengungkapkan tanda-tanda kegilaan manusia ini, tidak mungkin untuk membedakan mereka dari mutasi alami.

Tetapi kadang-kadang jejak dapat tetap ada, terutama jika pencipta tidak mencoba untuk menyembunyikan kegilaan manusia dari desain mereka. Pertama-tama, kita berbicara tentang tempat-tempat pemotongan DNA (saya ingat bahwa manipulasi dengan virus RNA dilakukan secara tepat dalam konstruksi DNA mereka), diperlukan bagi pembuat untuk menjahit segmen genom yang berbeda atau memotong situs lama dan menyisipkan. Memang, DNA dapat dipotong bukan di tempat yang sewenang-wenang (Crisper tidak dihitung), tetapi hanya di mana urutan nukleotida (biasanya 4-6 "huruf") bertepatan dengan urutan yang dikenali oleh satu atau enzim restriksi lain , yaitu, enzim yang memecah rantai nukleotida . Selain itu, analisis semacam itu memperumit fakta bahwa ada ratusan jenis enzim restriksi yang digunakan dalam rekayasa genetika. Tapi mari kita coba melakukan analisis untuk CoV2.

Untuk mulai dengan - contoh karya kelompok Barik dari 2008, di mana mereka mengambil Bat-SCoV dan mengganti RBD dalam protein lonjakannya dengan RBD dari manusia SARS. Begini cara mereka menggambarkan penciptaan chimera mereka:

SARS-CoV Bat-SCoV.
(A) SARS-CoV Bat-SCoV ( GenBank FJ211859) . () nsp ORF1ab ( , - ; , nsp5 [3C- ]). , , A F. , Bat-SCoV, SARS-CoV, , Bat-SCoV 2 , Bat-E1 Bat-E2, SARS-E.
Schematic representation of SARS-CoV and Bat-SCoV variants.
(A) Schematic representation of SARS-CoV and Bat-SCoV (GenBank accession no. FJ211859) genomes and reverse genetics system. (Top) Arrowheads indicate nsp processing sites within the ORF1ab polyprotein (open arrowheads, papain-like proteinase mediated; filled arrowheads, nsp5 [3C-like proteinase] mediated). Immediately below are the fragments used in the reverse genetics system, labeled A through F. The fragments synthesized to generate Bat-SCoV exactly recapitulate the fragment junctions of SARS-CoV with the exception that the Bat-SCoV has 2 fragments, Bat-E1 and Bat-E2, which correspond to the SARS-E fragment.

Seperti yang Anda lihat, pada awalnya kelompok Barik menciptakan klon sintetis kelelawar-SCoV, dan terlebih lagi, menggunakan "pola" klon sintetis SARS-CoV yang sebelumnya mereka buat. Yaitu, untuk klon kelelawar, mereka menggunakan 6 segmen yang sama dengan situs enzim restriksi yang sama yang sebelumnya mereka gunakan untuk SARS-CoV, yang memungkinkan mereka untuk menukar segmen virus antara strain yang berbeda seperti potongan Lego. Berikut ini adalah deskripsi terperinci untuk membuat mutan chimeric:

, - , SARS-CoV (24, 33, 53) . , Bat-F A-E SARS-CoV F Bat-SCoV, Bgl-NotI. Bat-SCoV Bat-SRBD, Bat-SRBM Bat-Hinge , 7 Bat-SCoV, BglI Bat-A, Bat-B, Bat-C Bat -D, BglI AflII Bat-E1 Bat-E2 BglI NotI Bat-F. , . m7Message mMachine (Ambion), Vero (24, 53).
Viruses containing PCR-generated insertions within the viral coding sequence were produced by using the SARS-CoV assembly strategy (24, 33, 53) with the following modifications. Briefly, for Bat-F virus, full-length cDNA was constructed by ligating restriction products from SARS-CoV fragments A–E and Bat-SCoV fragment F, which required a BglI-NotI digestion. For Bat-SCoV and Bat-SRBD, Bat-SRBM, and Bat-Hinge, plasmids containing the 7 cDNA fragments of the Bat-SCoV genome were digested by using BglI for Bat-A, Bat-B, Bat-C, and Bat-D, BglI and AflII for Bat-E1 and Bat-E2, and BglI and NotI for Bat-F. Digested, gel-purified fragments were simultaneously ligated together. Transcription was driven by using a T7 mMessage mMachine kit (Ambion), and RNA was electroporated into Vero cells (24, 53).

Semua singkatan tiga huruf ini (BglI, AflII, NotI, dll.) Dalam kalimat yang disorot di atas adalah berbagai jenis enzim restriksi. Mari kita lihat apakah akan ada perbedaan dalam situs enzim restriksi dalam genom (protein lonjakan) chimera dibandingkan dengan genom SARS-CoV asli:

Seperti dapat dilihat, situs enzim restriksi dari chimera hampir identik dengan potongan-potongan dari urutan asli dalam Bat-SCoV atau SARS dari tempat mereka diambil. Satu-satunya perbedaan yang terlihat di situs pengikat silang dari potongan SARS yang dimasukkan. Di sini, misalnya, tepi kiri (5'-) dari sisipan:

Di sini Bat-SCoV dan SARS ternyata memiliki daerah nukleotida identik yang sama (persimpangan pirus dan daerah merah muda), dan tidak ada situs enzim restriksi baru di tempat dua urutan penjahitan, sebaliknya, situs SspI dari SARS menghilang. Dan inilah tepi kanan (3'-) dari sisipan:

Di sini, sebaliknya, semua situs enzim restriksi lama tetap di tempat ikatan, dan bahkan yang baru muncul, misalnya, EcoR II. Jika saya tidak tahu bahwa genom chimeric adalah hasil dari manipulasi buatan manusia, dapatkah saya memahami ini dengan melihat 3 sekuens ini? Tidak mungkin bahwa bahkan jika beberapa kecurigaan merayap masuk, maka itu tentu saja tidak diragukan . Mungkin, spesialis dalam rekayasa genetika bisa melihat ini untuk beberapa tanda lain, saya tidak bisa mengatakan - Saya akan senang dengan program pendidikan apa pun di sini.

Tapi bagaimanapun, mari kita bandingkan protein lonjakan di RaTG13, CoV2 dan trenggiling-19. Tiba-tiba, sesuatu akan melompat pada kita saat ia melompat keluar!

Inilah yang tampak seperti RBD (tersorot dalam warna hijau muda) dan RBM (kuning) untuk ketiganya:

Apa yang menarik? Sangat menarik untuk melihat situs EcoR I pada 5'-edge RBM untuk ketiganya (sambungan pertama antara area hijau dan kuning) - sangat nyaman. Saya bertanya-tanya seberapa umum fitur ini di strain lain? Analisis sepintas menunjukkan bahwa trinitas kita adalah juara dalam jumlah situs semacam itu dalam genom, di galur kelelawar lain hanya ada 5 di antaranya:

Kembali ke analisis RBD, dari fitur CoV2, situs enzim restriksi baru yang disorot dalam persegi panjang merah dapat dicatat - mereka bertepatan dengan mutasi unik dalam urutan asam amino (juga ditandai dengan persegi panjang merah pada urutan asam amino di kolom paling kanan). Untuk berjaga-jaga, saya menyoroti beberapa situs baru: persegi panjang biru dan persegi panjang hijau, yang terletak di wilayah satu-satunya asam amino yang berbeda antara RBM CoV2 dan pangolin-19.

Mari kita bandingkan di ketiga strain tempat insert PRRA, yang menciptakan situs furin di CoV2:

Di sini juga, beberapa situs baru muncul (disorot dengan warna biru) di kedua sisi sisipan baru. Bisakah mereka digunakan untuk membuat situs furin? Secara teoritis, ya. Tetapi penyisipan dapat dilakukan dengan menggunakan situs yang ada, atau bahkan membuat segmen dengan situs baru, yang kemudian digabungkan dengan mulus, yaitu, tanpa membuat situs baru di persimpangan. Jika Anda ingat, Barik pada tahun 2002 menerapkan teknologi ini untuk membuat tiruan tiruan dari coronavirus tikus:

Situs persimpangan dari situs pembatasan yang terletak di ujung masing-masing cDNA secara sistematis dihapus selama perakitan produk cDNA ukuran penuh, yang memungkinkan pemasangan kembali tanpa modifikasi nukleotida.
Sumber teks
The interconnecting restriction site junctions that are located at the ends of each cDNA are systematically removed during the assembly of the complete full-length cDNA product, allowing reassembly without the introduction of nucleotide changes.

Dan pada tahun 2003 ia mengulangi klon sintetis SARS-CoV:

Untuk dengan cepat mengumpulkan klon konsensus, kami menggunakan endonucleases pembatasan IIS kelas, yang dipotong di daerah asimetris dan meninggalkan ujung asimetris. Enzim-enzim ini menghasilkan overhang unik khusus yang memberikan ligasi sempurna dari dua cDNA dengan hilangnya situs restriksi selanjutnya .
Sumber teks
To rapidly assemble consensus clones, we used class IIS restriction endonucleases that cut at asymmetric sites and leave asymmetric ends. These enzymes generate strand-specific unique overhangs that allow the seamless ligation of two cDNAs with the concomitant loss of the restriction site.

Saat ini, teknologi juggling dengan sekuens gen sudah begitu otomatis dan mulai digunakan sehingga dalam sebuah artikel China mulai Oktober 2019 tentang memasukkan situs furin baru ke dalam coronavirus ayam, hanya ada beberapa saran untuk deskripsinya:

2.2. Pembuatan virus rekombinan Virus
rekombinan rYN-S2 / RRKR, yang mengandung protein lonjakan dengan situs furin S2 ', diperoleh dengan rekombinasi vaksin, seperti yang dijelaskan sebelumnya [20, 28]. Secara singkat, sebuah situs S-furin plasmid dihasilkan menggunakan Seamless Assembly kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) dan ditransfungsikan menjadi sel CV-1 yang terinfeksi virus vaccinia yang mengandung gen YN- S-GPT. Situs Furin-S2 diperkenalkan ke dalam YN cDNA oleh rekombinasi homolog menggunakan sistem seleksi dominan temporal [25].
Sumber teks
2.2. Generation of Recombinant Virus
Recombinant rYN-S2/RRKR virus containing an S protein with the furin-S2? site was generated by vaccinia recombination, as described previously [20,28]. Briefly, plasmid with the furin-S2? site was generated using the Seamless Assembly kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) and transfected into CV-1 cells infected by vaccinia virus containing the genome of YN-?S-GPT. Furin-S2’ site was introduced into the YN cDNA by homologous recombination using the transient dominant selection system [25].

Mustahil untuk tidak mengagumi kemajuan apa yang telah terjadi! Berikut adalah deskripsi dari perangkat Majelis Seamless di atas :

GeneArt 1 4 , , 30- . E.coli .
• — 4 ( 13 ); ,
• — , , , 90% .
• —
• — - -,
• — , , .
The GeneArt Seamless Cloning and Assembly Kit enables the simultaneous and directional cloning of 1 to 4 PCR fragments, consisting of any sequence, into any linearized vector, in a single 30-minute room temperature reaction. The kit contains everything required for the assembly of DNA fragments, and their transformation into E. coli for selection and growth of recombinant vectors.
• Speed and Ease?—?Clone up to 4 DNA fragments, with sequence of your choice, simultaneously in a single vector (up to 13 Kb); no restriction digestion, ligation or recombination sites required
• Precision and Efficiency — Designed to let you clone what you want, where you want, in the orientation you want, and achieve up to 90% correct clones with no extra sequences left behind
• Vector Flexibility — Use our linear vector or a vector of your choice
• Free Tools — Design DNA oligos and more with our free web-based interface that walks you step-by-step through your project
• Diverse Applications — Streamline many synthetic biology and molecular biology techniques through the rapid combination, addition, deletion, or exchange of DNA segments

Hingga 4 fragmen DNA dapat direkatkan dalam urutan yang diinginkan hanya dalam setengah jam, tanpa sakit kepala dengan enzim restriksi atau ligasi. Dan unggah kreasi Anda ke E. coli untuk menyebarkan desain yang dihasilkan.

Merangkum analisis situs enzim restriksi, harus diakui bahwa tidak ada kesimpulan pasti yang dapat diambil dari hasilnya. Kecuali jika sekali lagi dimungkinkan untuk memastikan bahwa tidak hanya CoV2 yang unik, tetapi RaTG13 sendiri adalah kawan yang sangat tidak biasa, dan perlu dipelajari lebih lanjut biografinya.

Preferensi Codon

Untuk keperluan ini, saya juga memutuskan untuk melihat bias penggunaan kodon untuk melihat jenis virus lain yang terlihat seperti CoV2 dan RaTG13. Bukan rahasia lagi bahwa virus cenderung beradaptasi dalam tanda tangan kodon mereka dengan preferensi host mereka, jadi saya berharap untuk melihat pola yang sama dengan virus hepatomirus lain di RaTG13, dan juga berharap untuk melihat perbedaan dari strain pangolin.

Di sini SARS-CoV, misalnya, sangat mirip dengan Rs3367 dan RsSCH014, seperti yang Anda duga:

Di antara mereka sendiri, omong-omong, SARS, MERS dan CoV2 berbeda:

RaTG13 mirip dengan CoV2, yang juga diharapkan:

Tapi RaTG13 benar-benar tidak super mirip dengan strain trenggiling, dan strain trenggiling tidak persis identik satu sama lain:

Pada ZXC21 dan ZC45 juga tidak terlalu mirip:

Dari strain Yunnan, RaTG13 dari Rs3367 dan RsSCH014 cukup jauh, dan paling dekat dengan LYRa11, tetapi juga dengan perbedaan nyata:

Secara umum, seperti biasa, RaTG13 dan CoV2 entah bagaimana terpisah. Saya juga tertarik dengan kodon AAA - mereka menggunakannya lebih sering daripada sesama anggota suku:

Ini mungkin hanya kebetulan lain, tetapi proporsi yang sama antara AAA dan AAG diamati pada E. coli . Dapatkah tanda tangan cDNA cDNA berubah seperti yang dibudidayakan untuk waktu yang lama dalam kultur sel? Secara teori, ya, tapi saya belum menggali topik ini secara mendalam.

Analisis kodon juga tidak mengungkapkan tanda-tanda kreativitas yang jelas, tetapi sekali lagi menegaskan keunikan CoV2 dan RaTG13. Apa yang kita miliki dalam keadaan kering? Sejauh ini, hanya serangkaian kebetulan aneh tertentu, yang, seperti yang suka dikatakan para ilmuwan, disatukan , yaitu, secara agregat, membuat Anda berpikir sangat keras. Dan tentu saja itu tidak memungkinkan menolak hipotesis tentang sifat buatan manusia dari CoV2.

Tapi bagaimana dengan penolakan kegilaan manusia di Alam?

Bagaimana tidak memungkinkan? Dan mengapa penulis artikel itu di Nature mengizinkan? Faktanya, tidak ada bantahan tentang kegilaan manusia dalam artikel itu. Hanya ada suara keras "kami tidak berpikir begitu", berdasarkan pada fondasi yang sangat tidak stabil. Nilailah diri Anda sendiri - ini adalah poin utama penulis dalam mendukung keajaiban:

, SARS-CoV-2 ACE2 , , , RBD SARS-CoV [ SARS — ..] . , SARS-CoV-2 ACE2, , ACE2, . , SARS-CoV-2 .
While the analyses above suggest that SARS-CoV-2 may bind human ACE2 with high affinity, computational analyses predict that the interaction is not ideal and that the RBD sequence is different from those shown in SARS-CoV to be optimal for receptor binding. Thus, the high-affinity binding of the SARS-CoV-2 spike protein to human ACE2 is most likely the result of natural selection on a human or human-like ACE2 that permits another optimal binding solution to arise. This is strong evidence that SARS-CoV-2 is not the product of purposeful manipulation.

Kutipan dalam artikel ini ditunjukkan tepat di bawah diagram yang menunjukkan RBM identik CoV2 dan trenggiling-19. Tunggu, lalu apa hubungannya "simulasi komputer" dengannya? Skenario buatan manusia yang paling mungkin adalah pemindahan RBM dari satu jenis hewan ke jenis lainnya - yang telah dilakukan oleh ahli virologi berulang kali. Oleh karena itu, rantai logis penulis tidak tahan terhadap kritik: “pada komputer dimungkinkan untuk merancang virus yang lebih curam, jadi CoV2 adalah hasil seleksi alam. Oh, jadi ini bukti kuat bahwa CoV2 tidak dibuat dengan tangan! ” Rupanya, penulis memiliki logika yang buruk. Tesis selanjutnya mereka mengkonfirmasi ini:

, , , , -. , , SARS-CoV-2 - .
Furthermore, if genetic manipulation had been performed, one of the several reverse-genetic systems available for betacoronaviruses would probably have been used. However, the genetic data irrefutably show that SARS-CoV-2 is not derived from any previously used virus backbone.

Sekali lagi, kesalahan logis yang sama, terselubung oleh belokan yang keras: “analisis genetik membuktikan bahwa CoV2 jelas tidak dibuat berdasarkan virus yang diketahui sebelumnya!” Terima kasih, Kapten Evidence. Dan apa, sungguh, pencipta virus tidak dapat membuat tulang punggung cDNA dari jenis virus yang sebelumnya tidak dipublikasikan - misalnya, dari RaTG13 yang sama? Ya mudah. Juga, tidak akan sulit bagi mereka untuk kemudian memasukkan pangolinium RBM dan situs furin di sana. Ahli virologi telah melakukan ini selama 20 tahun, dan alat rekayasa genetika modern membuat manipulasi semacam itu dapat diakses bahkan oleh siswa.

Adapun asal-usul situs furin dalam kultur sel, penulis juga mengungkapkan tesis aneh:

, O- . in vitro in vivo. , SARS-CoV-2 - , . ACE2, , .
The acquisition of both the polybasic cleavage site and predicted O-linked glycans also argues against culture-based scenarios. New polybasic cleavage sites have been observed only after prolonged passage of low-pathogenicity avian influenza virus in vitro or in vivo. Furthermore, a hypothetical generation of SARS-CoV-2 by cell culture or animal passage would have required prior isolation of a progenitor virus with very high genetic similarity, which has not been described. Subsequent generation of a polybasic cleavage site would have then required repeated passage in cell culture or animals with ACE2 receptors similar to those of humans, but such work has also not previously been described.

Pertama, penulis sendiri sebelumnya menyediakan tautan ke karya tempat situs furin muncul saat virus dikultur dalam sel. Dan kedua, apa artinya strain virus yang serupa belum dijelaskan - tetapi bagaimana dengan RaTG13? Jika RBM secara sintetis diganti dengan pangolinium di dalamnya, dan kemudian strain chimeric dikultur dalam kultur sel, maka situs furin dapat muncul dengan cara ini dan juga, dengan cara yang sama, strain baru dapat memperoleh mutasi lain yang membedakan CoV2 dari RaTG13 dan pangolin-19 .

Tetapi dalam hal varian buatan manusia dari penampilan situs furin, saya lebih cenderung melihat opsi dengan insert yang ditargetkan - seperti pada karya Cina lain dari Oktober 2019 dengan chicken coronavirus. Dan kemudian strain yang diciptakan bisa memperoleh mutasi baru karena dibudidayakan secara in vitroatau in vivo sebagai strain murine dari MA15 pada tahun 2007, misalnya.

Shi Zhengli 2020

Ketika saya sedang menulis artikel ini, hasil kerja tim besar ahli virologi Cina, termasuk Shi Zhengli, di mana pada Februari mereka menguji CoV2 selama bertahun-tahun pengembangan mereka dari berbagai jenis virus coronavirus - sebuah peptida yang dirancang untuk memblokir fusi protein seperti lonjakan dengan membran sel , keluar . Para penulis, tentu saja, menyebutkan situs furin baru CoV2, dan menyarankan bahwa itu dapat memainkan peran penting dalam penetrasi CoV2 yang jauh lebih efisien ke dalam sel:

, SARS-CoV-2 , SARS-CoV, , SARS-CoV-2 .
…
, β- S1/S2, . , SARS-CoV , L . S1/S2 SARS-CoV .
In this study, we have shown that SARS-CoV-2 exhibits much higher capacity of membrane fusion than SARS-CoV, suggesting that the fusion machinery of SARS-CoV-2 is an important target for development of coronavirus fusion inhibitors.
…
Generally, β-B coronaviruses lack the S1/S2 furin-recognition site, and their S proteins are uncleaved in the native state. For example, SARS-CoV enters into the cell mainly via the endosomal membrane fusion pathway where its S protein is cleaved by endosomal cathepsin L and activated. Inducing the S1/S2 furin-recognition site could significantly increase the capacity of SARS-CoV S protein to mediate cellular membrane surface infection.

Dalam konteks ini, ini menjadi menarik, tetapi apakah penulis sebelumnya telah melakukan beberapa percobaan tentang bagaimana penambahan situs furin baru ke berbagai coronavirus dapat mempengaruhi efektivitas peptida mereka? Tapi kami tidak akan membuat tebakan yang tidak perlu, biarkan waktu menempatkan semuanya pada tempatnya.

Ngomong-ngomong, Barik, rupanya, memutuskan untuk mengikuti Shi Zhengli, dan juga bergabung dalam perlombaan untuk mencari dana dari CoV2. Seperti yang saya pahami, ia dan rekan penulis mengambil data yang sudah mereka miliki tentang keefektifan analog nukleosida mereka (β-D-N4-hydroxycytidine, NHC) terhadap SARS-CoV dan MERS, ditambahkan data in vitro pada CoV2, dan mengirimkannya untuk dicetak. Analog nukleosida (seperti remdesivir yang terkenal) Apakah pendekatan yang secara fundamental berbeda dari Shi Zhengli dan rekan penulis: di sini penulis mencoba untuk mencegah replikasi virus dengan menyelipkan huruf "cacat" dari alfabet genetik, dan Shi Zhengli dan rekan penulis mencoba untuk mencegah virus memasuki sel. Secara teoritis, pendekatan ini dapat digabungkan.

Inilah akhirnya, teman yang cantik

Oh, saya harap sampai saat ini setidaknya ada yang membaca. Maaf jika saya membuat Anda bosan. Dirinya kaget: lubang kelinci ternyata adalah kerajaan bawah tanah yang utuh. Saya juga berharap menarik bagi Anda untuk terjun ke dunia virologi dan secara terbuka mempertimbangkan hipotesis sifat buatan manusia CoV2. Menurut pendapat saya, set data yang saya kutip, secara agregat, tidak memungkinkan untuk menolak hipotesis ini.

Untuk berjaga-jaga, saya akan menjelaskan: ini TIDAK berarti bahwa CoV2 secara tepat disintesis di laboratorium. Ya, murni secara teknis, tidak akan sulit bagi seorang ahli virus modern untuk membuat tekanan semacam itu. Tetapi tidak ada bukti langsung bahwa ada yang melakukan ini. Dan kebetulan yang aneh belum bisa berfungsi bahkan sebagai bukti tidak langsung.

Tetapi hipotesis terbalik tentang sifat alami virus yang eksklusif juga belum didukung oleh bukti kuat. Sejauh ini, tidak ada nenek moyang antara telah ditemukan antara RaTG13, pangolin-19 dan CoV2, di mana dimungkinkan untuk melacak rekombinasi selektif yang kami amati dalam CoV2, pertanyaan tentang asal usulnya tetap terbuka. Mungkin tidak ada yang berbicara lebih baik daripada Ralph Barik sendiri :

Hewan apa yang merupakan pembawa zoonosis dari SARS-CoV-2?
Hewan seperti itu belum ditemukan. Ada bukti bahwa trenggiling berpotensi menjadi inang perantara, tetapi virus trenggiling hanya 88-98% identik dengan SARS-CoV-2. Sebagai perbandingan, strain virus luwak dan rakun dari SARS pertama adalah 99,8% identik dengan strain SARS-CoV 2003. Dengan kata lain, kita berbicara tentang beberapa mutasi antara galur musang, rakun dan manusia pada tahun 2003. Pangolin [CoV2 strain] memiliki lebih dari 3.000 perubahan nukleotida, sehingga trenggiling tidak bisa menjadi spesies reservoir. Sama sekali tidak ada peluang.
Sumber teks
What is the reservoir species of SARS-CoV-2?
They have not identified the actual reservoir species. Reports show that pangolins are potentially the intermediate host, but pangolin viruses are 88–98% identical to SARS-CoV-2. In comparison, civet and racoon dog strains of SARS coronaviruses were 99.8% identical to SARS-CoV from 2003. In other words, we are talking about a handful of mutations between civet strains, racoon dog strains and human strains in 2003. Pangolin [strains of CoV2] have over 3000 nucleotide changes, no way they are the reservoir species. Absolutely no chance.

Begitu seterusnya.

*************************************************** *****************************

UPD: sekitar 4% perbedaan antara genom RaTG13 dan Cov2

Beberapa kritikus hipotesis laboratorium berpendapat bahwa perbedaan genetik yang diamati ~ 4% antara RaTG13 dan CoV2 terlalu besar untuk ini terjadi di laboratorium jika RaTG13 sendiri digunakan sebagai dasar. Tingkat mutasi diamati virus RNA bervariasi secara luas - dari 10 ^-6 sampai 10 ^-4 nukleotida per di vitro replikasi , dan pada manusia, CoV2 tampaknya bermutasi pada tingkat 25 mutasi per tahun. Jadi, menurut logika kritik, akan butuh waktu bertahun-tahun, jika bukan beberapa dekade, untuk dua jenis ini berbeda 4%. Terlepas dari kenyataan bahwa ini adalah keberatan yang masuk akal, saya melihat beberapa masalah dengannya.

Pertama, di vitro tingkat mutasi yang jauh lebih tinggi dariin vivo , karena Anda dapat melewati sel lebih sering daripada menginfeksi hewan baru. Seperti yang ditunjukkan oleh percobaan dengan SARS dan MERS in vitro , mutasi yang signifikan dapat diamati setelah beberapa bagian. Sebagai contoh, dalam sebuah artikel tahun 2004, dilaporkan bahwa setelah 600 bagian, perbedaan 2,1% dalam urutan genom protein seperti lonjakan antara strain asli dan keturunannya telah diamati:

Selain itu, di hadapan beberapa obat antivirus, misalnya, analog nukleosida yang sama (ribavirin atau remdesivir) ), frekuensi mutasi pada virus RNA dapat meningkat tiga kali lipat:

. 10-4 , -. , 6 . in vitro , , , .
We obtained an estimate of the spontaneous mutation rate of ca. 10^-4 substitutions per site or lower, a value within the typically accepted range for RNA viruses. A roughly threefold increase in mutation rate and a significant shift in mutation spectrum were observed in samples from patients undergoing 6 months of interferon plus ribavirin treatment. This result is consistent with the known in vitro mutagenic effect of ribavirin and suggests that the antiviral effect of ribavirin plus interferon treatment is at least partly exerted through lethal mutagenesis.

Dengan demikian, jika nenek moyang laboratorium CoV2 diuji untuk menilai bagaimana mutagenesisnya dapat mengubah efektivitas vaksin potensial atau obat antivirus terhadapnya, ia dapat dengan cepat mengakumulasi perbedaan yang signifikan.

Tapi mungkin masalah terbesar dengan argumen perbedaan 4% adalah bahwa hal itu didasarkan pada fakta bahwa strain RaTG13 persis seperti yang dinyatakan WIV, dan bahwa tidak ada strain lain yang lebih dekat dalam koleksi mereka. Jika kita ingin secara terbuka mempertimbangkan hipotesis kebocoran laboratorium, kita harus mengakui bahwa kita tidak dapat sepenuhnya mempercayai data dari laboratorium yang sama yang diduga kebocoran. Jika kebocoran benar-benar terjadi, seperti yang dikemukakan dalam hipotesis, maka WIV sudah berusaha menyembunyikannya, dan data yang mereka berikan mungkin mengikuti tujuan yang sama.

, 100%- , . , , , , , , , . — — CoV2 , , , , , . , , , . , , , , .

Ngomong-ngomong, ada sesuatu yang bisa membantu mempercayai klaim WIV tentang sifat RaTG13 - jika mereka setuju untuk mentransfer sampel Yunnan 2013 mereka ke laboratorium independen, dari mana Shi Zhengli mengekstraksi RaTG13. Mereka masih harus memilikinya jika mereka mengurutkan genom RaTG13 lengkap dari mereka lagi pada tahun 2020.

*************************************************** *****************************

UPD2: RaTG13 - strain yang sama dengan RaBtCoV / 4991?

Setelah saya mempublikasikan posting ini, saya ditunjukkan ke pracetak yang menyatakan bahwa RaTG13 sebenarnya adalah strain RaBtCoV / 4991 ( KP876546 ), yang dilaporkan Shi Zhengli temukan pada 2013 di sebuah tambang Yunnan yang ditinggalkan pada 2016 . Ada beberapa alasan untuk berpikir demikian. Pertama-tama, satu-satunya urutan yang diterbitkan dari RaBtCoV / 4991 adalah 100% identik dengan urutan tingkat nukleotida RaTG13 , meskipun ini hanya 370 nukleotida dari gen RdRp:

Kedua, data tentang pengumpulan bahan dari mana strain ini diisolasi hampir identik: keduanya dikumpulkan pada bulan Juli 2013 dari apusan kelelawar R. affinis :

Sampel RaBtCoV / 4991 dikumpulkan di sebuah tambang yang berlokasi di Kabupaten Mujiang, yang berada di bawah yurisdiksi Puer:

Daerah Otonomi Mujiang adalah daerah otonom di bawah yurisdiksi kota Puer, di selatan Yunnan, Cina. Wikipedia

Dan kota Puer diindikasikan sebagai tempat berkumpulnya RaTG13 dalam basis data GISAID, yang mungkin merupakan indikasi perkiraan lokasi tambang di Mujiang.

Sungguh aneh bahwa dalam artikel 2020 tentang RaTG13, Shi Zhengli tidak menyebutkan RaBtCoV / 4991 dan tidak mengutip artikel 2016 tentang penemuannya, di mana ia diindikasikan sebagai "mengembangkan dan mengoordinasikan penelitian." Pada saat yang sama, RaBtCoV / 4991 tidak mungkin dilupakan sepenuhnya, karena disebutkan dalam sebuah artikel oleh kelompok Shi Zhengli dari tahun 2019, di mana ia termasuk dalam pohon filogenetik dari virus corona lainnya:

Saya ragu bahwa tempat RaBtCoV / 4991 di pohon ini ditentukan semata-mata berdasarkan fragmen 370 nukleotida, jadi saya berpikir bahwa pada awal 2019, kelompok Shi Zhengli telah mengurutkan genomnya.

Ngomong-ngomong, sangat menarik bahwa genom pangolin-2017 dan pangolin-2019 juga sangat dekat dengan RaTG13 dan CoV2 di wilayah gen RdRp ini, dan CoV2 dan pangolin-2019 memiliki beberapa mutasi umum yang tidak diamati pada RaTG13:

Saya juga memutuskan untuk membandingkan profil kodon antara RaTG13 dan strain lain dari R. affinis yang tinggal di tambang yang ditinggalkan sama. Sayangnya, hanya 816-nukleotida segmen dari gen RdRp ( RaBtCoV / 3750 dan RaBtCoV / 4307-2 ) yang diterbitkan untuk strain Ra lainnya , oleh karena itu, untuk membandingkan preferensi kodon, saya mengekstraksi segmen 816-nukleotida yang sesuai dari RaTG13. Akibatnya, RaTG13 sekali lagi terasa berbeda, sementara dua strain lainnya cukup dekat:

Sars ajaib? Silsilah dari Coronavirus Wuhan

Menit Perawatan UFO

Kami mendesak Anda untuk kritis terhadap informasi apa pun yang dipublikasikan.