Get best of the week

Wedge by wedge: penggunaan virus PIV5 untuk membuat vaksin melawan MERS-CoV dan kemungkinan terhadap SARS-CoV-2



Mengingat keadaan saat ini, sama sekali tidak mengejutkan bahwa komunitas ilmiah telah memusatkan semua kekuatannya pada pencarian dan pengembangan metode dan alat untuk memerangi virus yang menyebar. Hari ini kita melihat sebuah studi di mana para ilmuwan dari American Society for Microbiology (ASM) menggambarkan vaksin yang sangat bekerja melawan virus MERS, yang mulai menyebar pada tahun 2012. Menurut para ilmuwan, pengembangan mereka dapat membantu menciptakan vaksin melawan SARS-CoV-2 yang sedang berkecamuk. Apa kekhasan vaksin yang dibuat, dari mana vaksin itu dibuat, dan seberapa efektifkah vaksin melakukan tugasnya? Kami belajar tentang ini dari laporan para ilmuwan. Pergilah.

Menit Perawatan UFO


Pandemi COVID-19, infeksi pernafasan akut yang berpotensi parah yang disebabkan oleh coronavirus SARS-CoV-2 (2019-nCoV), telah secara resmi diumumkan di dunia. Ada banyak informasi tentang Habré tentang topik ini - selalu ingat bahwa Habré dapat diandalkan / bermanfaat, dan sebaliknya.

Kami mendesak Anda untuk kritis terhadap informasi apa pun yang dipublikasikan.


Sumber resmi

, .

Cuci tangan, rawat orang yang Anda cintai, tinggal di rumah kapan saja memungkinkan dan bekerja dari jarak jauh.

Baca publikasi tentang: coronavirus | kerja jarak jauh

Dasar studi


MERS atau sindrom pernapasan Timur Tengah adalah penyakit radang organ pernapasan yang berkembang akibat infeksi virus genus Betacoronavirus dari subfamili yang sekarang dikenal sebagai keluarga Coronavirinae.


Cuplikan MERS-CoV (kuning).

Sumber virus MERS-CoV lagi-lagi kelelawar. Kasus-kasus infeksi pertama di antara orang-orang tercatat pada tahun 2012 di wilayah Semenanjung Arab, tetapi pada tahun 2015 virus telah mencapai negara-negara Asia Timur dan Eropa. Menurut data terbaru, jumlah kasus infeksi MERS-CoV yang dikonfirmasi adalah 2.494 orang, di antaranya 858 orang meninggal (data dari 02.02.2020). Data bervariasi dari sumber ke sumber, tetapi jelas terlihat bahwa tingkat distribusi di MERS-CoV tidak sebesar di SARS-CoV-2. Namun demikian, virus Timur Tengah juga memiliki tingkat kematian yang agak tinggi - sekitar 35%. Indikator ini yang paling mengkhawatirkan.

MERS-CoV adalah virus RNA rantai positif * , di mana penetrasi ke dalam sel target dilakukan karena protein-Samplop virus * .
Virus RNA rantai positif * - RNA virus positif. Ini menyiratkan bahwa sekuens RNA virus tertentu dapat langsung diterjemahkan menjadi protein virus (misalnya, protein yang diperlukan untuk replikasi virus). Oleh karena itu, pada virus RNA dengan rantai positif, gen RNA virus dapat dianggap viral mRNA (messenger RNA) dan dapat segera diterjemahkan oleh sel inang.
Amplop virus * - amplop tambahan yang menutupi amplop luar (capsid) dari banyak virus.
Protein S terdiri dari subunit S1 yang bertanggung jawab untuk mengikat reseptor virus, dipeptidyl peptidase 4 (DPP4 atau CD26) melalui domain pengikatan reseptor (RBD dari domain pengikatan reseptor ), serta subunit S2, yang menyediakan fusi membran.

Peneliti ingat bahwa saat ini tidak ada vaksin terhadap MERS-CoV, hanya ada sejumlah perkembangan yang keefektifannya cukup diragukan. Para ilmuwan percaya bahwa pekerjaan mereka akan mengubah situasi ini.

Dalam studi ini, para ilmuwan memutuskan untuk mengalihkan perhatian mereka ke virus lain - PIV5. Virus PIV atau parainfluenza (PG) memiliki lima varietas, tiga di antaranya menyebabkan penyakit pada manusia (dari PG-1 hingga PG-3) dan dua yang tidak berbahaya bagi manusia (PG-4 dan PG-5).


Snapshot TEM virus parainfluenza.

PG-5 adalah anggota genus Rubulavirus dari keluarga Paramyxoviridae, yang meliputi virus gondong (MuV atau "gondong") dan virus parainfluenza manusia tipe 2 (PG-2) dan tipe 4 (PG-4). PG-5 mengkodekan delapan protein virus yang diketahui. Protein nukleokapsid (NP), fosfoprotein (P) dan protein RNA polimerase (L) penting untuk transkripsi * dan replikasi * genom RNA virus.
Transkripsi * - proses sintesis RNA menggunakan DNA sebagai templat; transfer informasi genetik dari DNA ke RNA.
Replikasi * adalah proses menciptakan dua molekul DNA anak perempuan berdasarkan DNA orangtua.
Para ilmuwan percaya bahwa PG-5 adalah kandidat yang sangat baik untuk vektor virus * untuk vaksin masa depan. PG-5 cukup aman, meskipun memiliki tingkat infeksi yang tinggi, yang dapat berperan dalam pembuatan vaksin yang efektif.
Vektor virus * adalah alat untuk mengirimkan materi genetik ke sel target.
Selain itu, PG-5 tidak memiliki fase DNA dalam siklus hidupnya, yang menghindari kemungkinan modifikasi genetik DNA sel inang secara tidak sengaja dengan rekombinasi atau penyisipan. Juga, struktur PG-5 cukup stabil, berbeda dengan virus RNA dengan rantai positif. Hal ini dikonfirmasi oleh PG-5 rekombinan yang dibuat yang mengekspresikan gen F untuk virus syncytial pernapasan, ketika gen F dipertahankan selama lebih dari 10 generasi.

Keuntungan lain dari PG-5 adalah efektivitas biaya, karena virus ini dapat tumbuh hingga 8x10 8 PFU / ml (PFU - unit pembentuk plak).

Sebelumnya, PG-5 sudah digunakan sebagai vektor virus ketika bekerja dengan vaksin melawan virus syncytial pernapasan dan rabies. Selama percobaan pada tikus, ditemukan bahwa vektor PG-5 yang mengekspresikan NA (neuraminidase, yang merupakan bagian dari membran) dari virus influenza, mengarah ke imunisasi lengkap dari subyek percobaan, yaitu 4 hari setelah infeksi, tidak ada satu pun kasus kematian atau bahkan infeksi. Tetapi PG-5, yang mengekspresikan NP (nucleoprotein), melindungi 100% tikus percobaan dari strain mematikan dari virus influenza H1N1.

Berdasarkan hasil positif dari penelitian sebelumnya, para ilmuwan memutuskan untuk menggunakan PG-5 sebagai vektor virus yang mengekspresikan protein virus MERS. Seperti sebelumnya, semua percobaan dilakukan pada tikus.

Hasil penelitian


Para peneliti sebelumnya memperkenalkan gen HA (hemagglutinin) dari virus influenza A ke tempat yang berbeda dalam genom PG-5 dan menemukan bahwa memasukkan dalam SH (hidrofobik kecil) dan HN (hemagglutinin-neuraminidase) memberikan respon kekebalan yang lebih baik.
Virus influenza hemagglutinin dan neuraminidase * adalah antigen permukaan virus, memberikan kemampuan untuk menempel pada sel target.
Mengingat hal ini, diputuskan untuk memperkenalkan gen S berukuran penuh dari virus MERS di persimpangan SH dan HN. Plasmid * yang mengandung cDNA * PG-5 berukuran penuh dengan gen S yang disisipkan di persimpangan SH dan HN dibangun menggunakan metode kloning molekuler standar ( 1A ).


Gambar No. 1
Plasmid * adalah molekul DNA kecil yang dipisahkan dari kromosom dan mampu replikasi independen.
cDNA * - DNA komplementer, mis. DNA disintesis pada matriks mRNA matang (messenger RNA) dalam suatu reaksi yang dikatalisis oleh reverse transcriptase.
Plasmid ditransfusikan * menjadi sel BHK * bersama dengan plasmid yang mengekspresikan TG, NP, P dan L RNA polimerase dari virus PG-5 (PIV5).
Transfeksi * - pengenalan asam nukleat ke dalam sel dengan metode non-virus.
Sel-sel BHK * ( ginjal bayi hamster ) adalah sel-sel jaringan ikat (fibroblast) ginjal hamster yang sensitif terhadap banyak virus yang mempengaruhi manusia. Sel BHK digunakan untuk transformasi, serta untuk transeksi stabil dan sementara.
Hasilnya adalah virus menular PIV5-MERS-S, yang selanjutnya dimurnikan dan dikalikan dalam jumlah besar dalam sel MDBK * untuk analisis lebih lanjut.
Sel MDBK * ( sel ginjal taring Madin-Darby ) - sel ginjal anjing, pertama kali diisolasi pada tahun 1958 oleh para ilmuwan SH Madin dan NB Darby. Sel-sel ini digunakan dalam penelitian sebagai model sel mamalia.
Genom virus diurutkan dan dikonfirmasi bahwa mengandung urutan DNA input yang diinginkan. Selanjutnya, perlu untuk memeriksa ekspresi protein S dalam sel yang terinfeksi PIV5-MERS-S. Untuk ini, sel-sel terinfeksi pada nilai-nilai MOI * yang berbeda , setelah itu mereka dilisiskan (dilarutkan) untuk immunoblotting * menggunakan antibodi anti-S.
MOI * ( multiplisitas infeksi ) - multiplisitas infeksi, mis. rasio agen (virus) terhadap target infeksi (sel).
Immunoblotting * adalah metode yang sangat sensitif untuk mendeteksi protein, berdasarkan kombinasi elektroforesis dan enzim immunoassay atau analisis radioimun.
Analisis menunjukkan adanya protein S dan S2 yang penuh, yang menunjukkan keberhasilan penerapannya ( 1B ). Ekspresi protein S dalam sel yang terinfeksi PIV5-MERS-S dikonfirmasi lebih lanjut dengan analisis imunofluoresensi ( 1C ).

Para ilmuwan mencatat bahwa PIV5-MERS-S menyebabkan pembentukan syncytium * masif dalam sel Vero * . Selain itu, kinetika pertumbuhan PIV5-MERS-S dan PG-5 konvensional (PIV5) sangat mirip ( 1D ).
Syncytium * adalah jenis jaringan di mana sel-sel tidak sepenuhnya terpisah, yaitu ada bagian sitoplasma dengan nukleus yang saling berhubungan oleh plasmodesmata (jembatan sitoplasma).
Vero* — , .


Image No. 2

Imunisasi PIV5-MERS-S menghasilkan antibodi penawar dan imunitas yang diperantarai sel-T. Untuk menentukan apakah PIV5-MERS-S dapat menghasilkan respons imun, tikus diimunisasi dengan dosis tunggal PIV5-MERS-S atau mengendalikan virus PIV5-GFP pada 10 4 PFU atau 10 6 PFU per individu melalui rute intranasal.

Sementara kedua dosis menimbulkan respon antibodi, titer penetralkan sederhana pada 1:64 dan 1: 128 untuk 10 4 dan 10 6 dosis, masing-masing ( 2A dan 2B ).

Para ilmuwan ingat bahwa tikus spesies C57BL / 6 dan BALB / c setelah imunisasi masing-masing menghasilkan respon imun dominan Th1 dan Th2.
Th (T-helpers) - T-limfosit yang meningkatkan respon imun adaptif (kekebalan yang didapat).

Th1 - mempromosikan pengembangan respon imun seluler dengan mengaktifkan makrofag.

Th2 - mengaktifkan limfosit B, yang membantu perkembangan respon imun humoral.
Satu dosis PIV5-MERS-S (10 6 PFU) menghasilkan titer antibodi penawar hingga 1: 2000 pada tikus BALB / c ( 2C ), yang konsisten dengan respon dominan Th2 pada tikus spesies ini.

Untuk mengevaluasi respons utama sel T CD8 * yang dihasilkan oleh imunisasi dengan PIV5-MERS-S, tikus hDPP4-KI diimunisasi secara intranasal dengan PIV5-MERS-S (10 4 PFU).
CD8* ( 8) — , - .
Empat minggu kemudian, pagar diambil untuk memeriksa ada / tidaknya sel T CD8 residen MERS-CoV spesifik ( 3A ).


Gambar No. 3

Seperti yang ditunjukkan dalam 3B - 3D , ada peningkatan yang signifikan dalam persentase dan jumlah sel CD8-IFN di paru-paru tikus yang diimunisasi dengan PIV5-MERS dibandingkan dengan mereka yang terinfeksi PIV5-GFP.

Untuk mengevaluasi respon sel T CD8 spesifik MERS-S, dilakukan injeksi MERS-CoV MA tambahan (10 4 PFU). Akibatnya, peningkatan yang signifikan dalam tanggapan sel T CD8 pada hari keempat terlihat dibandingkan dengan tikus yang terinfeksi dengan kontrol PIV5-GFP ( 3E - 3G)

Peningkatan 10 kali lipat dalam sel T CD8 spesifik MERS-S juga diamati dibandingkan dengan tanggapan utama sel T CD8 ( 3B - 3G ).


Gambar No. 4

Sebagai hasil dari imunisasi PIV5-MERS-S mencegah kematian infeksi pada tikus. Untuk menentukan efektivitas PIV5-MERS-S dalam pencegahan atau modifikasi virus MERS-CoV, tikus hDPP4 KI diimunisasi dengan PIV5-MERS-S (10 4 PFU) dengan rute intranasal.

4 minggu setelah imunisasi, tikus yang terinfeksi MERS-S dimodifikasi untuk menjadi lebih aktif pada tikus ( 4A ). Semua tikus yang diimunisasi dengan PIV5-MERS-S selamat dari infeksi mematikan ini, dengan sedikit penurunan berat badan ( 4B dan4C ). Sebaliknya, semua tikus yang terinfeksi dengan kontrol PIV5-GFP atau PBS meninggal setelah infeksi. Ini menunjukkan bahwa PIV5-MERS-S sepenuhnya melindungi tikus dari infeksi mematikan.

Terlepas dari kenyataan bahwa tikus yang diimunisasi PIV5-MERS-S memiliki tingkat pembersihan paru-paru yang lebih tinggi dari virus, metode ini tidak memberikan kekebalan sterilisasi lengkap ( 4D ).


Image No. 5

Studi histopatologis paru-paru setelah infeksi menunjukkan bahwa tikus yang diimunisasi dengan PIV5-MERS-S memiliki lebih sedikit puing seluler * dan lebih banyak infiltrat mononuklear ( 5A dan 5B ).
Puing-puing sel * adalah sisa sel yang dikelilingi oleh membran plasma yang difagositosis oleh makrofag.
Infiltrasi leukosit yang kuat (terutama sel mononuklear) dan lebih sedikit kerusakan (edema, membran hialin, puing-puing sel nekrotik, dll.) Juga terdeteksi.

Pada tahap akhir penelitian, para ilmuwan mengevaluasi respon perlindungan yang diinduksi oleh PIV5-MERS-S atau MERS-CoV yang tidak aktif. Untuk ini, beberapa tikus diimunisasi dengan PIV5-MERS-S (10 4 PFU) atau PBS, sementara yang lain diimunisasi dengan MERS-CoV yang dilemahkan oleh UV.

Sementara PIV5-MERS-S memberikan perlindungan 100% terhadap infeksi mematikan, MERS-CoV yang tidak aktif hanya melindungi 25% tikus (gambar di bawah).


Gambar No. 6

Selanjutnya, penelitian dilakukan pada paru-paru tikus yang pertama kali diimunisasi dan kemudian terinfeksi MERS-CoV (gambar di bawah).


Gambar No. 7

Lebih banyak eosinofil (sejenis sel darah putih) diamati di paru-paru pada tikus yang diimunisasi dengan MERS-CoV yang tidak aktif daripada pada tikus yang diimunisasi dengan PBS atau PIV5-MERS-S setelah infeksi dengan MERSCoV.

Dibandingkan dengan PBS, infiltrasi eosinofilik perivaskular secara signifikan meningkat pada kelompok MERS-CoV yang tidak aktif, tetapi tidak ada perbedaan statistik yang diamati dibandingkan dengan kelompok yang diimunisasi dengan PIV5-MERS-S.

Sebuah penilaian juga dibuat dari pembentukan membran hialin di alveoli paru-paru, yang merupakan tanda jelas penyakit paru-paru yang parah. Dibandingkan dengan kelompok PBS, tikus yang diimunisasi dengan PIV5-MERS-S menunjukkan perlindungan yang signifikan terhadap pembentukan membran hialin. Tetapi tikus yang diimunisasi dengan MERS-CoV yang tidak aktif hanya menunjukkan sedikit penurunan pembentukan membran hialin, yang menunjukkan rendahnya efisiensi metode imunisasi ini dibandingkan dengan PIV5-MERS-S.

Untuk seorang kenalan yang lebih mendetail dengan nuansa penelitian, saya sarankan Anda membaca laporan para ilmuwan .

Epilog


Dalam karya ini, para ilmuwan dapat menunjukkan metode yang cukup berhasil mengimunisasi tikus dengan virus MERS-CoV, yang telah berjalan bebas di planet kita sejak 2012.

Fitur pembeda utama dari metode yang dikembangkan adalah penggunaan virus lain, yaitu PG-5, sebagai vektor virus. Dengan kata lain, irisan dihancurkan oleh irisan.

Penggunaan virus sebagai transportasi untuk pengiriman gen yang diperlukan untuk imunisasi dapat dianggap sebagai metode yang agak tidak biasa, tetapi dapat berkontribusi untuk memerangi virus yang lebih efektif. Para peneliti sendiri mengatakan bahwa pekerjaan mereka tidak hanya bertujuan memerangi MERS-CoV, tetapi juga dengan SARS-CoV-2 (COVID-19). Kedua virus itu milik subfamili yang sama, memiliki jalur infeksi dan efek yang serupa pada sel target. Jika metode imunisasi yang dikembangkan dikembangkan lebih lanjut, maka dimungkinkan untuk membuat vaksin yang cukup efektif.

Inilah yang penulis rencanakan untuk dilakukan di masa depan. Apakah mereka berhasil membuat vaksin super atau tidak, waktu akan memberi tahu. Namun, sekarang mereka layak mendapat pujian setidaknya untuk memperhatikan virus, yang sepertinya semua orang lupa.

Bagaimanapun, kita hanya bisa berharap bahwa sains dan semua orang yang terlibat, seperti berkali-kali sebelumnya, dapat mengatasi semua prasangka dan ketakutan, mengatasi semua hambatan dan menunjukkan bahwa pemikiran analitis berdasarkan pengetahuan dan logika selalu mampu menemukan jalan keluar dari situasi saat ini, tidak peduli seberapa mengerikan pada pandangan pertama itu mungkin.

Terima kasih atas perhatian Anda, tetap ingin tahu dan selamat bekerja, kawan.

Sedikit iklan :)


Terima kasih untuk tetap bersama kami. Apakah Anda suka artikel kami? Ingin melihat materi yang lebih menarik? Dukung kami dengan melakukan pemesanan atau merekomendasikan kepada teman Anda, cloud VPS untuk pengembang dari $ 4,99 , analog unik dari server entry-level yang diciptakan oleh kami untuk Anda: Seluruh kebenaran tentang VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps mulai dari $ 19 atau cara membagi server? (opsi tersedia dengan RAID1 dan RAID10, hingga 24 core dan hingga 40GB DDR4).

Dell R730xd 2 kali lebih murah di pusat data Equinix Tier IV di Amsterdam? Hanya kami yang memiliki 2 x Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 TV dari $ 199 di Belanda!Dell R420 - 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB - mulai dari $ 99! Baca tentang Cara Membangun Infrastruktur Bldg. kelas c menggunakan server Dell R730xd E5-2650 v4 seharga 9.000 euro untuk satu sen?

More articles:


All Articles