Kami mewawancarai Dr. Amusa Buminasan dari SENS Research Foundation di konferensi Ending Age-Related Diseases 2019 tentang penelitiannya tentang terapi restoratif mitokondria, pentingnya percobaan hewan percobaan, dan pandangannya tentang masa depan penelitian penuaan.
Amusa Buminasan menerima gelar Master dan PhD dalam bidang Biokimia dari Universitas Pune dan Laboratorium Kimia Nasional di India. Dia terus meneliti mitokondria di Universitas Pennsylvania dan Universitas Rutgers di Amerika Serikat. Dia mempelajari secara rinci mekanisme fusi dan pembagian dalam mitokondria, biosintesis kluster besi-belerang dan pengiriman protein ke mitokondria sebagai bagian dari magang pasca-doknya di American Heart Association.Amusa saat ini memimpin program MitoSENS di Mountain View, California. Tim penelitiannya sedang mempelajari mutasi DNA mitokondria (mtDNA) dan mengembangkan metode untuk mengembalikan fungsi yang hilang sebagai akibat dari mutasi ini oleh ekspresi allotopik gen mitokondria. Mutasi mtDNA herediter dapat menyebabkan penyakit parah dan melemahkan seperti NARP, Lei syndrome, dan MELAS.Dengan menggunakan teknologinya, tim MitoSENS telah berhasil dalam ekspresi gen ATP8 yang stabil, dan berharap untuk mengulangi keberhasilan untuk semua 13 gen dalam waktu dekat. Tujuan mereka adalah untuk mengembangkan terapi gen yang aman dan efektif untuk pengobatan disfungsi mitokondria.Wawancara
Thomas Warner Lehner : Tim riset Anda mulai mengembangkan metode canggih untuk ekspresi allotopic mtDNA pada tahun 2015, dan telah menunjukkan hasil yang sangat menjanjikan. Apa hambatan untuk ekspresi allotopic yang diatasi metode baru ini dan apa, menurut Anda, apakah ini berarti untuk penelitian lebih lanjut tentang hewan model?Amusa Buminasan : Hambatan utama yang diatasi adalah bahwa kami setidaknya mengekspresikan semua 13 gen. Kami menggunakan satu pendekatan untuk membuat beberapa koreksi serius pada semua 13 gen, tetapi pendekatan ini mungkin bekerja secara berbeda untuk mereka. Mungkin kita harus mendesain ulang pendekatan yang ditunjukkan untuk masing-masing gen karena fitur mereka.Jadi, ketiga gen berbeda dalam panjang, hidrofobisitas, dan kompleks yang mereka targetkan. Kendala utama adalah faktor hidrofobisitas. Protein menutupi membran mitokondria bagian dalam dalam beberapa lapisan, dan Anda perlu mendapatkannya dari luar. 13 protein ini disintesis dalam matriks dan diintegrasikan ke dalam kompleksnya. Tetapi dengan ekspresi allotop, mereka disintesis dalam sitosol dan harus melewati dua membran, dan kemudian sampai ke tempat yang tepat. Mitokondria sendiri memiliki translocases (enzim yang mengkatalisasi transfer ion atau molekul melalui membran) dari membran luar dan dalam, yang bekerja secara berbeda. Tergantung pada tujuannya, mekanisme yang berbeda akan terlibat.Kita harus mengembangkan protein secara berurutan, satu demi satu, atau mengubah masing-masing sehingga mereka mengenali dan menggunakan jalur yang benar. Kami akan membuat koreksi umum untuk semua 13 gen, dan di samping itu, kami akan membuat koreksi pribadi masing-masing untuk membuatnya berfungsi. Langkah pertama adalah setidaknya melihat hasilnya - dan langkah ini telah selesai.Thomas Warner Lehner : Kriteria apa yang memandu MitoSENS ketika memilih gen untuk bekerja pada ekspresi allotopic?Amusa Buminasan: Salah satu kendala adalah memeriksa apakah teknologi kami benar-benar berfungsi, dan untuk ini kami membutuhkan sistem model. Alasan yang memungkinkan kami untuk menunjukkan bahwa ATP8 berfungsi adalah adanya garis sel pasien dengan mutasi serius yang nol untuk ATP8. Mutasi MtDNA pada manusia muncul pada tingkat yang berbeda, tetapi agak tidak biasa bagi pasien untuk benar-benar kekurangan protein. Ini adalah peristiwa langka. Tetapi DNA mitokondria ada dalam heteroplasmi . Rasio mitokondria mutan dan normal adalah faktor yang menentukan fenotipe penyakit. Atau penyakit ini tertahan karena fakta bahwa mtDNA normal menekan DNA mutan.Salah satu alasan mengapa kami yakin bahwa ATP8 berfungsi dengan benar adalah karena kami berhasil mendapatkan garis sel nol dan menunjukkan bahwa protein eksogen sampai ke tempat yang tepat dan mengembalikan banyak fungsinya. Bahkan, garis sel kanan tersedia untuk kita - kesuksesan yang jarang. Nah, mengapa tidak memanfaatkan ini?Thomas Warner Lehner : Sebuah tinjauan yang diterbitkan pada bulan April tahun ini oleh sekelompok ilmuwan Cina membahas manfaat menggunakan lalat Drosophila sebagai model untuk mempelajari mutasi mtDNA. Bisakah Anda menjelaskan mengapa kelompok MitoSENS lebih suka melakukan penelitian pada tikus daripada lalat?Amusa Buminasan: Seperti yang kita pelajari di konferensi ini, lalat, di tingkat biokimia, memastikan metode tertentu bekerja, tetapi Anda memerlukan mamalia yang lebih tinggi untuk melanjutkan ke uji klinis pada manusia. Sekali lagi, kebetulan kami memiliki model penyakit tikus untuk gen ATP8. Ini adalah model yang sangat bagus tanpa mutasi nol; protein tersebut masih tersedia, tetapi merupakan protein dengan fungsi rendah.Gejala penyakitnya ringan, tetapi sangat penting. Mereka adalah karakteristik untuk diabetes atau resistensi insulin. Dari sudut pandang perilaku, tikus tidak tahan stres. Karena ini, jika allotopic ATP8 bekerja dan jika kita dapat mensintesisnya di dalam sel sel tikus dan mengembalikan fungsinya, kita dapat dengan mudah menunjukkan bahwa keadaan tubuh telah kembali normal, baik dari sudut pandang biokimia maupun perilaku. Itu sebabnya kami lebih suka tikus sebagai hewan model.Thomas Warner Lehner : Mengapa pengembangan dan penggunaan Tikus yang Dimodifikasi Secara Dimaksimalkan merupakan langkah penting dalam pengembangan terapi anti-penuaan?Amusa Buminasan: Seperti yang Anda tahu, SENS mendanai Mouse yang Dimodifikasi Secara Maksimal. Saat ini, terapi gen biasanya dilakukan dengan menggunakan vektor virus terkait adeno, terapi mereka bersifat sementara. Bahkan sekarang, Dr. Blasco telah mengkonfirmasi ini. Ada beberapa keuntungan karena efeknya hanya sementara - sepertinya akan melemah pada waktunya. Tetapi dalam konteks ekspresi allotopic, kami ingin efeknya stabil dan permanen. Berkat Mouse Dimaksimalkan yang Dimodifikasi, kita dapat menempatkan seluruh gen ke dalam genom. Menggunakan virus terkait adeno, Anda dibatasi oleh muatan yang dapat Anda kontribusikan ke genom. Dan tujuan kami adalah untuk memperkenalkan semua 13 gen ke dalam genom dari waktu ke waktu. Ini adalah standar yang tinggi, tetapi justru itulah yang ingin kita capai.Untuk mencapai hal ini, kami menciptakan Mouse yang Dimodifikasi Secara Maksimal untuk menempatkan setidaknya satu gen di dalamnya. Kami ingin, di masa depan, untuk menempatkan gen lain dalam genomnya sehingga transkripsi dan terjemahannya dikontrol dengan cara yang sama seperti gen mitokondria lain yang terletak di dalam nukleus dikendalikan. Mouse Maksimal yang Dapat Dimodifikasi paling cocok untuk ini.Thomas Warner Lehner: Alternatif untuk ekspresi allotopic adalah ekspresi xenotropik dari protein spesies lain yang berfungsi dengan cara yang sama. Contoh ekspresi xenotropik yang berhasil telah ditunjukkan dalam ascidia oksidase alternatif, yang sepenuhnya memulihkan kelangsungan hidup beberapa Drosophila yang bermutasi. Bisakah Anda mengatakan apa saja kelebihan ekspresi allotopik dibandingkan dengan ekspresi xenotropik dalam hal penggunaan terapi pada manusia.Amusa Buminasan: Kami ingin ini memanusiakan mungkin. Gen-gen ini asing dalam genom nuklir. Anda mungkin sudah memperkenalkan profil kekebalan baru yang dihasilkan oleh gen alien ini. Sekarang, jika Anda ingin menggunakan ekspresi xenotropic, ini akan membuat lebih banyak perubahan. Dari sudut pandang pengujian, kita harus memeriksa semua gen organisme lain yang telah jatuh ke dalam nukleus. Kita bisa membuat perubahan ini, tetapi kita ingin perubahan itu semanusiawi mungkin.Banyak dari gen-gen ini, yang bermigrasi ke inti selama evolusi, memperoleh berbagai perubahan yang memungkinkan mereka untuk berubah. Pada beberapa hewan, Kompleks I berfungsi hanya karena satu protein, seperti NDI1dalam ragi. Tetapi dalam sel manusia, untuk fungsinya, diperlukan 47 protein, 7 di antaranya disintesis dari DNA mitokondria, dan 40 sisanya dari DNA nuklir.Anda tidak akan ingin mengekspresikan protein asing (NDI1), dan kemudian mencoba mengembalikan fungsinya. Dari sudut pandang murni eksperimental, Anda dapat melakukan ini, tetapi menggunakannya sebagai terapi pada orang bukanlah ide yang baik jika Anda ingin mempertahankan integritas seluruh kompleks biokimia. Saya bahkan tidak bisa membayangkan kesulitan apa yang mungkin timbul dalam proses tersebut. Terapi gen itu sendiri kompleks, dan sekarang bayangkan terapi gen sebagai sesuatu seperti gen dari ragi.Thomas Warner Lehner : Istilah realistis apa untuk penampilan terapi manusia yang bisa Anda sebutkan?Amusa Buminasan: Sebenarnya, terapi ini sudah ada, tetapi untuk versi yang ditranskode. Artinya, kita sudah memiliki preseden. Yang perlu kita lakukan adalah menunjukkan bahwa versi kita lebih baik dan memiliki profil kekebalan yang lebih baik. Itu sebabnya kami ingin melakukannya pada hewan model - untuk menunjukkan betapa jauh lebih baik itu. Saya tidak bisa menyebutkan tanggalnya - ini adalah pertanyaan yang sangat sulit. Selama konferensi, seseorang sudah bertanya kepada saya. Jika penelitian pada hewan berjalan dengan baik, maka lima tahun. Bukan lima tahun sebelum terapi manusia, tetapi lima tahun menunjukkan bahwa metode ini cukup baik, untuk memulai pengembangan terapi manusia berdasarkan itu.Thomas Warner Lehner: Ada beberapa faktor yang mendukung akumulasi mutasi pada mtDNA dari waktu ke waktu. Apakah perlu untuk melengkapi ekspresi allotopic dari gen mtDNA dengan terapi lain yang akan mengurangi jumlah mutasi yang muncul dari waktu ke waktu untuk melihat efek yang terlihat pada penuaan?Amusa Buminasan : Pertanyaan bagus. Jika Anda melengkapi ekspresi allotopic dengan apa yang sudah Anda miliki, misalnya idebenone, elamipretide, atau yang serupa, ini akan berguna. Semuanya adalah antioksidan dan meningkatkan fungsi fosforilasi oksidatif .Namun, ini adalah masalah terapi gen pada pasien, penyakit mereka mungkin tidak berkontribusi pada adopsi terapi ini. Kompleks biokimia mereka tidak berfungsi penuh, tetapi terapi komplementer hanya memengaruhi sebagian kaskade, sementara mitokondria umumnya tidak berfungsi sebagaimana mestinya. Anda mungkin ingin memperbaiki penyakit mereka ke tingkat tertentu, dan hanya setelah itu menerapkan terapi gen untuk memastikan bahwa terapi gen bekerja.Mengenai penuaan, pertanyaan yang bisa diperdebatkan adalah apakah mutasi mtDNA merupakan faktor utama dalam penuaan atau tidak. Tujuan kami adalah untuk membantu pasien dan, jika mungkin, melangkah lebih jauh.Thomas Warner Lehner : Apa, menurut Anda, penelitian dalam bioteknologi anti-penuaan yang paling dibutuhkan saat ini untuk maju sebanyak mungkin dalam bidang ini dalam 10 tahun ke depan?Amusa Buminasan : Saya pikir kita perlu biomarker yang baik. Inilah yang kurang di lapangan. Semua orang menginginkan perbaikan cepat. Ada berbagai bidang penelitian, dan masing-masing peneliti menganggap dirinya penting untuk memerangi penuaan, tetapi saya tidak berpikir mereka baik-baik saja. Saya pikir penuaan lebih seperti pemecahan seluruh kompleks dari waktu ke waktu. Karena itu, kita membutuhkan penanda yang lebih baik dan mungkin pemahaman yang lebih baik tentang apa artinya menjadi sehat (di usia tua). Orang seharusnya tidak tahan dengan kenyataan bahwa dengan bertambahnya usia mereka akan menua dan kemudian mati. Mungkin perlu untuk menarik perhatian publik terhadap masalah tersebut sehingga orang-orang mengerti bahwa keinginan normal dan dapat menjadi sehat sepanjang hidup.Thomas Warner Lehner : Pertanyaan mana, dari pertanyaan yang belum pernah Anda tanyakan, yang ingin Anda dengar dari wartawan?Amusa Buminasan : Ini adalah pertanyaan sulit yang tak terduga. Saya tidak bisa menjawabnya sekarang. Namun, saya ingin mengatakan sesuatu tentang MitoMouse . Atas nama MitoTeam di SENS, saya ingin mengucapkan terima kasih kepada LEAF atas bantuan mereka.ReferensiPfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann N. (2019). Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews: Mol Cell Bio, 20, 267-284.
Stefano, G.B., Bjenning, C., Wang, F., Wang, N., Kream, R.M. (2017). Mitochondrial Heteroplasmy. Advances in experimental medicine and biology, 982, 577-594.
Chen, Z., Zhang, F., Xu, H. (2019). Human mitochondrial DNA diseases and Drosophila models. Journal of Genetics and Genomics, 46(4), 201-212.
Chen, Z., Qi, Y., French, S., Zhang, G., Covian Garcia, R., Balaban, R., Xu, H. (2015). Genetic mosaic analysis of a deleterious mitochondrial DNA mutation in Drosophila reveals novel aspects of mitochondrial regulation and function. Mol. Biol. Cell, 26, 674-684.
Boominathan, A., Vanhoozer, S., Basisty, N., Powers, K., Crampton, A.L., Wang, X., Friedricks, N., Schilling, B., Brand, M.D., OβConnor, M.S. (2016). Stable nuclear expression of ATP8 and ATP6 genes rescues a mtDNA Complex V null mutant. Nucleic Acids Research, 44(19), 9342β9357.
Brandt, U. (2006). Energy converting NADH:quinone oxidoreductase (complex I). Annual Review of Biochemistry, 75, 69β92.
Diterjemahkan oleh Vladislav Genzhera, SENS Volunteers