Get best of the week

"Lihat, ini sesuatu": replikasi DNA buatan sendiri



Salah satu ciri pembeda utama dari setiap organisme hidup adalah kemampuan untuk menyimpan dan mereproduksi informasi yang diperlukan untuk membuat jenisnya sendiri. Ini terutama memanifestasikan dirinya dalam replikasi DNA, ketika sepasang anak perempuan muncul dari DNA induk yang sama, yang merupakan salinan tepat dari nenek moyang mereka. Di alam, proses ini diamati di mana-mana, tetapi sangat sulit untuk membuatnya kembali di bawah kondisi laboratorium dari awal, namun, ini cukup realistis.

Ilmuwan dari Institut Biokimia. Max Planck (Jerman) berhasil menciptakan sistem biologis yang memiliki kemampuan untuk mereplikasi DNAnya sendiri. Teknik apa yang digunakan untuk membuat DNA replikasi sintetik, seberapa efektif sistem yang dihasilkan, dan apa arti penemuan ini bagi biologi sintetis modern? Kami akan menemukan jawaban untuk pertanyaan-pertanyaan ini dalam laporan para ilmuwan. Pergilah.

Dasar studi


Di bidang menciptakan sistem biologis buatan, kemampuan untuk mereplikasi adalah aspek kunci dari kegunaan sistem yang dibuat. Menurut para ilmuwan, ini dapat dicapai melalui penerapan komponen dasar: replikasi * , transkripsi * dan terjemahan DNA * .
* — .
* — , .. .
* — , .
Dengan kata lain, untuk menciptakan kehidupan artifisial yang lengkap, perlu untuk menerapkan reproduksi yang dikodekan-sendiri, mis. replikasi diri. Ini adalah proses yang sangat rumit dan membingungkan.

Para penulis penelitian mencatat bahwa dalam sistem yang didasarkan pada biokimia yang ada, misalnya, MPC ( sel berbasis protein minimal) , replikasi sendiri memerlukan pemikiran ulang biologi molekuler yang lengkap, termasuk replikasi, transkripsi dan terjemahan DNA, dengan mempertimbangkan lingkungan yang sepenuhnya bebas sel.

Sintesis protein dari DNA dapat dicapai dalam sistem rekombinan tertentu berdasarkan fasa * RNA polimerase - bagian utama dari mekanisme penerjemahan Escherichia coli dan sistem regenerasi energi minimal, mis. MURNI - Sintesis protein Menggunakan Elemen Rekombinan (Sintesis protein menggunakan elemen rekombinan).
Bakteriofag atau fag * adalah virus yang secara selektif menginfeksi sel bakteri dan archaeal. Dalam biologi, ini digunakan sebagai vektor (DNA untuk mentransfer materi genetik ke dalam sel).
Sementara itu, masih sangat sulit untuk menciptakan kembali proses replikasi DNA genom berdasarkan transkripsi dan translasi (TTcDR - transkripsi - replikasi DNA yang digabungkan ), yang menyandikan semua komponen makromolekul dari sistem PURE menggunakan reploma yang dikodekan sendiri * .
Replisoma * adalah kompleks multi-protein yang mereplikasi DNA bakteri.
Replikasi DNA berdasarkan DNA polimerase (DNAP) dari fag (mis., Phi29) dapat membantu menerapkan teknik TTcDR.

Namun, dalam metode TTcDR, genom Phi29 berukuran penuh hanya dapat dicapai dengan memblokir beberapa faktor replikasi.

Semua metode di atas memiliki keunggulan teoretis, tetapi dalam praktiknya mereka tidak memberikan hasil penuh. Dalam pekerjaan yang kami pertimbangkan saat ini, para ilmuwan menggambarkan sistem terjemahan yang menyediakan replikasi dan ekspresi gen-gen besar DNA yang dikodekan sendiri dalam kondisi bebas sel yang jelas. Secara khusus, replikasi diri genom lebih dari 116 kb tercapai. (seribu pasang nukleotida), mencakup berbagai faktor terjemahan Escherichia coli(Escherichia coli), ketiga RNA ribosom, sistem regenerasi energi, serta RNA dan DNA polimerase * .
Polymerase * adalah enzim yang melakukan sintesis polimer asam nukleat. DNA polimerase mensintesis DNA, dan RNA polimerase mensintesis RNA. Proses ini berlangsung melalui penyalinan komplementer DNA atau RNA orang tua.
Selain itu, sistem yang dibuat menunjukkan kemampuan untuk mensintesis lebih dari 30 faktor terjemahan, setengahnya menyatakan dalam jumlah yang sama atau lebih besar dari yang sebelumnya.

Hasil penelitian


Pada tahap pertama, para ilmuwan menguji TTCDR yang bergantung pada Phi29-DNAP yang dikodekan menggunakan protokol standar sistem PURExpress .

Wilayah pengkodean Phi29-DNAP diapit oleh promotor * T7 pertama kali dikloning ke dalam vektor TOPO pCR-Blunt (pREP, 1a ).
Promoter * adalah urutan nukleotida DNA yang digunakan oleh RNA polimerase sebagai wilayah untuk inisiasi transkripsi.


Gambar No. 1

Secara teori, arsitektur ini harus menyediakan replikasi RNA spontan sebagai cincin bergulir * menggunakan DNAP yang disandikan sendiri tanpa protein replikasi tambahan atau primer DNA yang disediakan secara eksternal.
Rolling Ring Type Replication * adalah proses replikasi asam nukleat searah di mana terjadi sintesis cepat beberapa salinan cincin DNA atau molekul RNA.
Namun, dengan menggunakan reaksi PURExpress standar dengan dNTP (nukleotida yang mengandung deoksiribosa C 5 H 10 O 4 ) dan 4 nM pREP (medium LB yang ditambah dengan zeocin C 55 H 86 N 20 O 21 S 2 ), sintesis DNA tidak terdeteksi menggunakan elektroforesis gel agarosa * , atau dengan reaksi berantai polimerase * ( 1b dan 1c ).
* — , .
* — .
Untuk meningkatkan replikasi DNA tanpa keterlibatan sistem PURE khusus, diputuskan untuk mengoptimalkan protokol reaksi PURExpress standar. Untuk ini, jumlah relatif faktor terjemahan, ribosom, dan agen pereduksi meningkat sementara menurunkan tingkat tRNA (transport RNA) dan rNTP (ribonucleoside triphosphate) ( 1d ).

Dengan menggunakan komposisi PURE yang dioptimalkan ini (PURErep), dimungkinkan untuk mencapai âˆŧ5-12 kali lipat unit monomer pREP dalam reaksi TTcDR ( 1b dan 1e ). Sintesis pREP ukuran penuh dikonfirmasi oleh pencernaan MluI * dari produk replikasi ( 1c ).
MluI * adalah endonuclease pembatasan yang tersedia secara komersial, yaitu enzim yang mengkatalisis hidrolisis asam nukleat.
Ekspresi protein fluoresen hijau (sfGFP) digunakan sebagai faktor evaluasi aktivitas terjemahan. Ditemukan bahwa perubahan komposisi PURE menyebabkan penurunan sintesis protein sebesar 20-40% dibandingkan dengan PURE tanpa TTcDR. Namun, penurunan ekspresi protein ini tetap dapat diterima mengingat peningkatan kompatibilitas sistem PURErep dengan replikasi DNA.

Analisis replikasi DNA berdasarkan qPCR mengungkapkan waktu penggandaan yang stabil (1-2 jam) untuk berbagai konsentrasi matriks awal, sementara replikasi DNA berlanjut bahkan setelah 24 jam pada 30 ° C ( 1e ).

TTcDR juga stabil untuk lebih dari lima generasi pengenceran berurutan ketika hanya 4% dari produk reaksi PURErep / pREP yang telah selesai ditransfer langsung ke campuran PURErep baru ( 1f) Kesimpulan utama dari pengamatan ini adalah bahwa produk TTcDR dapat berfungsi sebagai templat untuk replikasi diri DNA selama beberapa generasi.

Para ilmuwan mencatat bahwa sejumlah besar produk dengan mobilitas elektroforesis rendah adalah tipikal untuk replikasi sebagai cincin bergulir, yang diamati selama percobaan. Produk-produk reaksi ini dapat diwakili oleh concatemers dengan berat molekul tinggi * dan / atau cluster DNA / MgPPi.
Concatemer * - beberapa salinan dari sekuens DNA yang dikumpulkan dalam sebuah cluster sekuensial.
Pembentukan produk dengan ukuran ~ 5 kb juga terdeteksi. dalam sampel yang tidak diobati. Oleh karena itu, reaksi TTcDR dapat menghasilkan salinan monomer pREP dalam jumlah yang signifikan.

Selain itu, para ilmuwan mampu mengubah produk E. coli setelah pengangkatan plasma induk. Produk reaksi murni yang dihasilkan identik dalam ukuran dengan pREP monomer.

Pada tahap berikutnya, para ilmuwan memutuskan untuk membuat satu set gen yang mengkode komponen penting dari reaksi PURE: 31, faktor terjemahan penting (FT) dari bakteri E. coli .

Untuk ini, TTcDR dari pREP (4,6 kb) dipelajari bersama dengan masing-masing dari tiga plasmid besar *: pLD1 (30 bp, 13 FT), pLD2 (20 bp, 8 FT) dan pLD3 (23 bp, 9 FT). Semua dari mereka dikloning untuk memberikan ekspresi rekombinan dari 30 dari 31 faktor terjemahan bakteri E. coli .
Plasmid * adalah molekul DNA kecil yang mampu direplikasi secara independen.
Produk TTcDR dari keempat plasmid (termasuk pREP) menunjukkan fitur pembatasan MluI yang identik: klasmal plasmid, biasanya diperbanyak dalam E. coli ( 2a ).


Image No. 2

Perlu dicatat juga bahwa produk-produk pLD TTcDR dapat secara langsung diubah menjadi E. coli , di mana mereka disimpan sebagai plasmid monomer.

Campuran PURErep yang dimodifikasi juga menyediakan replikasi lengkap dari ketiga plasmid pLD bersama dengan PURErep selama reaksi dalam media umum ( 2b ).

Para ilmuwan tidak berhenti di situ dan pada tahap penelitian selanjutnya mereka mencoba memperluas beban genetik sistem TTcDR dengan menggandakan plasmid yang menyandikan komponen tambahan dari sistem PURE: EF-Tu (pEFTu), yang tidak ada dalam sistem pLD, serta operasi RNA ribosomal * rrnB ( prRNA adalah prekursor rRNA) yang mengkodekan 23S rRNA (ribosomal RNA), 16S rRNA, 6S rRNA dan tRNA (transport RNA, dalam hal ini Glu2) ( 2c ).
Operon * adalah unit fungsional genom uniseluler, yang meliputi gen yang mengkode protein.
Eksperimen QPCR yang menargetkan amplikon spesifik-plasmid * mengkonfirmasi bahwa unit monomer dari semua enam plasmid (panjang total DNA adalah 93 kb) direplikasi sekitar 2-8 kali dibandingkan dengan angka asli ( 2c ).
Amplikon * adalah unit amplifikasi ekstrachromosomal ( menyalin bagian DNA).
Konfirmasi tambahan tentang keberhasilan replikasi plasmid sendi adalah pembentukan koloni yang resisten terhadap zeocin (pREP), atau terhadap kanamisin (plasmid pLD dan prRNA), atau terhadap carbenicillin (pEFTu). Koloni-koloni ini adalah hasil dari transformasi produk reaksi PURErep yang diobati dengan DpnI ( 2d ).

26 koloni klon yang dipilih diikuti oleh analisis pembatasan sekali lagi menegaskan keberhasilan TTcDR dari semua enam plasmid ( 2e ).

Dengan menggunakan metode yang sama seperti yang dijelaskan sebelumnya, para ilmuwan melakukan prosedur lain untuk replikasi bersama dari lima plasmid tambahan: gen untuk sistem regenerasi minimal nukleosida trifosfat berdasarkan kreatin kinase (pCKM), adenilat kinase (pAK1) dan nukleosida difosfat kinase (pNDK); serta T7 RNA polimerase (T7RNAP) dan pyrophosphatase (pIPP).


Gambar No. 3

Dengan ukuran total 116,3 kb set 11 plasmid ini mencapai> 100% dari perkiraan panjang genom yang diusulkan untuk sistem replikasi diri minimal yang hanya bergantung pada nutrisi berat molekul rendah ( 3a ).

Para ilmuwan kemudian memutuskan untuk memeriksa apakah PURErep dapat memberikan ekspresi gen paralel selama replikasi. Untuk ini, ekspresi multicistronic dari FT dikodekan pada tiga plasmid pLD: pLD1, pLD2 dan plD3 (tidak termasuk pEFTu) diperiksa.

Untuk menyelidiki apakah PURErep secara umum dapat mendukung ekspresi multikistronik dari plasmid ini, ekspresi bebas sel dilakukan dari masing-masing individu plasmid di hadapan BODIPY-Lys-tRNALys, yang menyediakan pelabelan fluoresensi produk terjemahan.

Untuk meningkatkan sensitivitas deteksi dan memungkinkan kuantifikasi protein yang baru disintesis, analisis kuantitatif ekspresi protein selanjutnya dilakukan berdasarkan spektrometri massa menggunakan label isotop stabil.


Gambar No. 4

Analisis ini memberikan bukti yang meyakinkan untuk sintesis semua subunit FT protein yang dikodekan oleh pLD ( 4a ). Regenerasi protein parsial atau lengkap yang dikodekan dalam pLD2 dan pLD3 juga diamati.

Analisis ekspresi menunjukkan bahwa bahkan dalam PURErep yang tidak dimodifikasi dalam kombinasi dengan pREP, terdapat replikasi lengkap 32 cidron FT yang dikodekan oleh pLD, dan ekspresi sekitar setengah dari rantai peptida FT yang dikodekan, jumlah yang sesuai dengan atau melebihi yang awal.

Untuk seorang kenalan yang lebih mendetail dengan nuansa penelitian ini, saya sarankan Anda melihat laporan para ilmuwan dan bahan tambahan untuk itu.

Epilog


Dalam karya ini, para ilmuwan berhasil mencapai apa yang sebelumnya hanya bisa diimpikan oleh rekan-rekan mereka - menciptakan sistem buatan yang mampu mereplikasi diri.

Berlebihan mengatakan ini berarti bahwa mereka dapat mengambil langkah pertama menuju menciptakan sistem yang akan mereproduksi sendiri, dengan demikian mensimulasikan proses biologis sebanyak mungkin.

Para penulis penelitian sangat senang dengan hasil dan berencana untuk memperluas genom buatan dengan segmen DNA tambahan di masa depan. Mereka ingin membuat sistem dengan cangkang yang dapat menjaga kelangsungan hidup dengan menyerap nutrisi dan membuang limbah. Struktur buatan semacam itu dapat digunakan sebagai bio-perangkat produksi khusus untuk bahan-bahan alami atau sebagai dasar untuk menciptakan sistem yang bahkan lebih kompleks.

Kloning adalah proses yang kompleks, yang tidak diragukan lagi, tetapi penciptaan sistem sintetis yang lengkap dan layak adalah level yang sama sekali berbeda. Seseorang akan mengatakan bahwa penelitian semacam itu berbahaya, karena tidak ada yang berhak memikul tanggung jawab sebagai ibu alam. Namun, keingintahuan seseorang hampir tidak mungkin untuk tenang. Keinginan kami untuk memahami segalanya dan mengulang semuanya adalah salah satu faktor pendorong dalam kemajuan ilmu pengetahuan. Baik atau buruk, ini adalah pertanyaan yang tidak ada jawaban tunggal. Kita hanya bisa mengagumi pencapaian pikiran cerdas dan dengan hati-hati melihat ke masa depan, sambil berharap utopia.

Terima kasih atas perhatian Anda, tetap penasaran dan selamat berakhir pekan, semuanya! :)

Sedikit iklan :)


Terima kasih untuk tetap bersama kami. Apakah Anda suka artikel kami? Ingin melihat materi yang lebih menarik? Dukung kami dengan melakukan pemesanan atau merekomendasikan kepada teman Anda, cloud VPS untuk pengembang dari $ 4,99 , analog unik dari server entry-level yang diciptakan oleh kami untuk Anda: Seluruh kebenaran tentang VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps mulai dari $ 19 atau cara membagi server? (opsi tersedia dengan RAID1 dan RAID10, hingga 24 core dan hingga 40GB DDR4).

Dell R730xd 2 kali lebih murah di pusat data Equinix Tier IV di Amsterdam? Hanya kami yang memiliki 2 x Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 TV dari $ 199 di Belanda!Dell R420 - 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB - mulai dari $ 99! Baca tentang Cara Membangun Infrastruktur Bldg. kelas c menggunakan server Dell R730xd E5-2650 v4 seharga 9.000 euro untuk satu sen?

More articles:


All Articles