🙍🏻 🌡️ 👨🏿‍⚕️ "देखो, यह कुछ है": कृत्रिम डीएनए की आत्म-प्रतिकृति 👨🏿‍🔬 ♐️ 👲

किसी भी जीवित जीव की मुख्य विशिष्ट विशेषताओं में से एक अपनी तरह का निर्माण करने के लिए आवश्यक जानकारी को बचाने और पुन: पेश करने की क्षमता है। यह मुख्य रूप से डीएनए प्रतिकृति में ही प्रकट होता है, जब एक ही माता-पिता के डीएनए से बेटी की एक जोड़ी दिखाई देती है, जो उनके पूर्ववर्ती की एक सटीक प्रति है। प्रकृति में, इस प्रक्रिया को हर जगह देखा जाता है, लेकिन इसे खरोंच से प्रयोगशाला की स्थितियों के तहत फिर से बनाना बेहद मुश्किल है, हालांकि, यह काफी यथार्थवादी है।

जैव रसायन विज्ञान संस्थान के वैज्ञानिक। मैक्स प्लांक (जर्मनी) ने सफलतापूर्वक एक जैविक प्रणाली बनाई जो अपने डीएनए को दोहराने की क्षमता रखती है। सिंथेटिक प्रतिकृति डीएनए बनाने के लिए किन तकनीकों का उपयोग किया गया, परिणामी प्रणाली कितनी प्रभावी है, और आधुनिक सिंथेटिक जीव विज्ञान के लिए इस खोज का क्या मतलब है? हम वैज्ञानिकों की रिपोर्ट में इन सवालों के जवाब पाएंगे। जाओ।

अध्ययन का आधार

कृत्रिम जैविक प्रणाली बनाने के क्षेत्र में, दोहराने की क्षमता निर्मित प्रणाली की उपयोगिता का एक प्रमुख पहलू है। वैज्ञानिकों के अनुसार, यह मूल घटकों के कार्यान्वयन के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है: प्रतिकृति * , प्रतिलेखन * और डीएनए अनुवाद * ।

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दूसरे शब्दों में, एक पूर्ण कृत्रिम जीवन बनाने के लिए, स्व-एन्कोडेड प्रजनन को लागू करना आवश्यक है, अर्थात। आत्म प्रतिकृति। यह एक अत्यंत जटिल और भ्रामक प्रक्रिया है।

अध्ययन के लेखकों ने ध्यान दिया कि मौजूदा जैव रसायन पर आधारित प्रणालियों में, उदाहरण के लिए, एमपीसी ( न्यूनतम प्रोटीन-आधारित कोशिकाएं) , स्व-प्रतिकृति के लिए आणविक जीव विज्ञान की पूरी तरह से पुनर्विचार की आवश्यकता होती है, जिसमें प्रतिकृति, प्रतिलेखन और डीएनए का अनुवाद शामिल है, जो पूरी तरह से सेल-मुक्त वातावरण को ध्यान में रखते हैं।

डीएनए से प्रोटीन संश्लेषण फेज * आरएनए पोलीमरेज़ के आधार पर कुछ पुनः संयोजक प्रणालियों में प्राप्त किया जा सकता है - एस्चेरिशिया कोलाई के अनुवाद तंत्र के मुख्य भाग और न्यूनतम ऊर्जा उत्थान की प्रणाली, अर्थात्। शुद्ध - पुनः संयोजक तत्वों का उपयोग करते हुए प्रोटीन संश्लेषण (प्रोटीन संश्लेषण पुनः संयोजक तत्वों का उपयोग करके)।

Bacteriophages या Phages * ऐसे वायरस हैं जो चुनिंदा रूप से बैक्टीरिया और आर्कियल कोशिकाओं को संक्रमित करते हैं। जीव विज्ञान में, यह एक वेक्टर के रूप में उपयोग किया जाता है (सेल में आनुवंशिक सामग्री को स्थानांतरित करने के लिए डीएनए)।

इस बीच, प्रतिलेखन और अनुवाद (TTcDR - प्रतिलेखन - अनुवाद-युग्मित डीएनए प्रतिकृति ) के आधार पर जीनोम की डीएनए प्रतिकृति की प्रक्रिया को फिर से बनाना बेहद मुश्किल है , जो कि स्वयं-एन्कोडेड प्रतिकृति * के लिए PURE प्रणाली के सभी मैक्रोलेमीक्यूलर घटकों को कूटबद्ध करता है ।

रेप्लिसोमा * एक मल्टी-प्रोटीन कॉम्प्लेक्स है जो बैक्टीरियल डीएनए की प्रतिकृति बनाता है।

डीएनए पोलीमरेज़ (DNAP) पर आधारित डीएनए प्रतिकृति (जैसे, Phi29) TTcDR तकनीक को लागू करने में मदद कर सकती है।

हालाँकि, TTcDR विधि में, पूर्ण आकार के Phi29 जीनोम को केवल कुछ प्रतिकृति कारकों को अवरुद्ध करके प्राप्त किया जा सकता है।

उपरोक्त सभी विधियों के अपने सैद्धांतिक फायदे हैं, लेकिन व्यवहार में उन्होंने पूर्ण परिणाम नहीं दिया। आज हम जिस काम पर विचार कर रहे हैं, उसमें वैज्ञानिकों ने एक अनुवाद प्रणाली का वर्णन किया है जो अच्छी तरह से परिभाषित सेल-फ्री परिस्थितियों में बड़े डीएनए जीनोम की स्व-एन्कोडेड प्रतिकृति और अभिव्यक्ति प्रदान करता है। विशेष रूप से, 116 केबी से अधिक के जीनोम की आत्म-प्रतिकृति हासिल की गई थी। (न्यूक्लियोटाइड्स के हजार जोड़े), अनुवाद कारकों की पूरी श्रृंखला को कवर करते हुए एस्चेरिचिया कोलाई(एस्चेरिचिया कोलाई), सभी तीन राइबोसोमल आरएनए, ऊर्जा पुनर्जनन प्रणाली, साथ ही आरएनए और डीएनए पोलीमरेज़ * ।

पॉलिमरेज़ * एक एंजाइम है जो न्यूक्लिक एसिड के पॉलिमर के संश्लेषण का कार्य करता है। डीएनए पोलीमरेज़ डीएनए को संश्लेषित करता है, और आरएनए पोलीमरेज़ आरएनए को संश्लेषित करता है। यह प्रक्रिया पैतृक डीएनए या आरएनए की पूरक नकल के माध्यम से आगे बढ़ती है।

इसके अलावा, बनाई गई प्रणाली ने 30 से अधिक अनुवाद कारकों को संश्लेषित करने की क्षमता का प्रदर्शन किया, जिनमें से आधे परिचयात्मक लोगों के बराबर या उससे अधिक मात्रा में व्यक्त होते हैं।

शोध का परिणाम

पहले चरण में, वैज्ञानिकों ने PURExpress प्रणाली के मानक प्रोटोकॉल का उपयोग करके आत्म-एन्कोडेड Phi29-DNAP पर निर्भर TTcDR का परीक्षण किया ।

Phi29-DNAP कोडिंग क्षेत्र * T7 प्रमोटर द्वारा फ्लैंक किया गया था जिसे पहले pCR-ब्लंट TOPO वेक्टर (pREP, 1a ) में क्लोन किया गया था ।

प्रमोटर * एक डीएनए न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम है जिसका उपयोग आरएनए पोलीमरेज़ द्वारा प्रतिलेखन दीक्षा के लिए एक क्षेत्र के रूप में किया जाता है।

छवि संख्या 1

सिद्धांत रूप में, इस वास्तुकला को एक प्रतिकृति रिंग के रूप में सहज आरएनए प्रतिकृति प्रदान करनी चाहिए * अतिरिक्त प्रतिकृति प्रोटीन के बिना स्वयं एन्कोडेड डीएनएपी का उपयोग करना या बाहरी रूप से डीएनए प्राइमर प्रदान करना।

रोलिंग रिंग प्रकार प्रतिकृति * एक यूनिडायरेक्शनल न्यूक्लिक एसिड प्रतिकृति प्रक्रिया है जिसके दौरान रिंग डीएनए या आरएनए अणुओं की कई प्रतियों का तेजी से संश्लेषण होता है।

हालांकि, dNTP (युक्त न्यूक्लियोटाइड सी के साथ मानक PURExpress प्रतिक्रिया का उपयोग कर ₅ एच ₁₀ हे ₄ deoxyribose ) और 4 एनएम तैयारी (एलबी मध्यम सी Zeocin के साथ पूरक ₅₅ एच ₈₆ एन ₂₀ हे ₂₁ एस ₂ ), डीएनए संश्लेषण का उपयोग कर नहीं पाया गया agarose जेल वैद्युतकणसंचलन * , न ही वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन * ( 1 बी और 1 सी ) द्वारा।

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विशेष PURE सिस्टम की भागीदारी के बिना डीएनए प्रतिकृति में सुधार करने के लिए, मानक PURExpress प्रतिक्रिया प्रोटोकॉल का अनुकूलन करने का निर्णय लिया गया। इसके लिए, tRNA (ट्रांसपोर्ट RNA) और rNTP (राइबोन्यूक्लियोसाइड ट्राइफॉस्फेट) ( 1d ) के स्तर को कम करते हुए अनुवाद कारकों, राइबोसोम और रिड्यूसिंग एजेंट की सापेक्ष संख्या में वृद्धि की गई ।

इस अनुकूलित शुद्ध संरचना (PURErep) का उपयोग करते हुए, TTcDR प्रतिक्रियाओं ( 1b और 1e ) में pREP मोनोमेरिक इकाइयों की -5–12-गुना प्रतिकृति प्राप्त करना संभव था । पूर्ण आकार pREP संश्लेषण प्रतिकृति उत्पाद ( 1c ) के MluI पाचन * द्वारा पुष्टि की गई थी ।

MluI * एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रतिबंध एंडोन्यूक्लाइज है, अर्थात। एक एंजाइम जो न्यूक्लिक एसिड के हाइड्रोलिसिस को उत्प्रेरित करता है।

हरे रंग की फ्लोरोसेंट प्रोटीन (sfGFP) की अभिव्यक्ति का उपयोग अनुवाद गतिविधि के मूल्यांकन कारक के रूप में किया गया था। यह पाया गया कि PURE की संरचना में बदलाव से TTcDR के बिना PURE की तुलना में 20-40% तक प्रोटीन संश्लेषण में कमी आई है। हालांकि, डीएनए अभिव्यक्ति के साथ Purerep प्रणाली की बेहतर संगतता को देखते हुए प्रोटीन की अभिव्यक्ति में यह कमी स्वीकार्य है।

QPCR पर आधारित डीएनए प्रतिकृति के विश्लेषण से विभिन्न प्रारंभिक मैट्रिक्स सांद्रता के लिए एक स्थिर दोहरीकरण समय (1-2 घंटे) का पता चला, जबकि डीएनए प्रतिकृति 30 डिग्री सेल्सियस ( 1e ) पर 24 घंटे के बाद भी जारी रही ।

TTcDR क्रमिक कमजोर पड़ने की पांच से अधिक पीढ़ियों के लिए भी स्थिर था जब समाप्त Purerep / pREP प्रतिक्रिया उत्पाद का केवल 4% सीधे नए Purerep मिश्रण ( 1f) में स्थानांतरित कर दिया गया था) इस अवलोकन का मुख्य निष्कर्ष यह है कि TTcDR उत्पाद कई पीढ़ियों से डीएनए आत्म-प्रतिकृति के लिए टेम्पलेट के रूप में काम कर सकते हैं।

वैज्ञानिक ध्यान दें कि एक रोलिंग रिंग के रूप में प्रतिकृति के लिए कम इलेक्ट्रोफोरेटिक गतिशीलता के साथ उत्पाद की एक महत्वपूर्ण मात्रा विशिष्ट है, जो प्रयोगों के दौरान देखी गई थी। इन प्रतिक्रिया उत्पादों का प्रतिनिधित्व उच्च आणविक भार सहकर्मी * और / या डीएनए / MgPPi समूहों द्वारा किया जा सकता है ।

Concatemer * - एक अनुक्रमिक क्लस्टर में इकट्ठे डीएनए अनुक्रमों की कई प्रतियां।

~ 5 केबी के आकार वाले उत्पादों के गठन का भी पता लगाया गया था। अनुपचारित नमूनों में। यह निम्नानुसार है कि TTcDR प्रतिक्रियाएं महत्वपूर्ण मात्रा में pREP मोनोमेरिक प्रतियाँ उत्पन्न कर सकती हैं।

इसके अलावा, वैज्ञानिक माता-पिता के प्लाज्मा को हटाने के बाद ई कोलाई उत्पादों को बदलने में सक्षम थे । परिणामस्वरूप शुद्ध किए गए प्रतिक्रिया उत्पाद मोनोमेरिक pREPs के आकार के समान थे।

अगले चरण में, वैज्ञानिकों ने PURE प्रतिक्रिया के महत्वपूर्ण घटकों को कूटने वाले जीन का एक सेट बनाने का निर्णय लिया: 31, ई। कोलाई बैक्टीरिया का एक आवश्यक अनुवाद कारक (FT) ।

इसके लिए, तीन बड़े प्लास्मिड * में से प्रत्येक के साथ संयोजन में pREP (4.6 kb) से TTcDR का अध्ययन किया गया था ।: पीएलडी 1 (30 बीपी, 13 एफटी), पीएलडी 2 (20 बीपी, 8 एफटी) और पीएलडी 3 (23 बीपी, 9 एफटी)। उन सभी को ई। कोलाई बैक्टीरिया के 31 अनुवाद कारकों में से 30 की पुनः संयोजक अभिव्यक्ति प्रदान करने के लिए क्लोन किया गया था ।

प्लास्मिड * छोटे डीएनए अणु हैं जो स्वतंत्र प्रतिकृति के लिए सक्षम हैं।

सभी चार प्लास्मिड (pREP सहित) के TTcDR उत्पादों में समान MluI प्रतिबंध विशेषताएं दिखाई गईं: क्लोनल प्लास्मिड्स, आमतौर पर ई। कोलाई ( 2a ) में प्रचारित होते हैं ।

छवि संख्या 2

यह भी ध्यान देने योग्य है कि pLD TTcDR उत्पादों को सीधे ई। कोलाई में बदला जा सकता है , जहां उन्हें मोनोमेरिक प्लास्मिड के रूप में संग्रहीत किया जाता है।

संशोधित Purerep मिश्रण ने एक सामान्य माध्यम ( 2b ) में प्रतिक्रिया के दौरान Purerep के साथ मिलकर सभी तीन PLD प्लास्मिडों की पूरी प्रतिकृति प्रदान की ।

वैज्ञानिक वहाँ नहीं रुके और पहले से ही अध्ययन के अगले चरण में उन्होंने PURE प्रणाली के अतिरिक्त घटकों को सह-प्रतिकृति प्लास्मिड्स द्वारा TTcDR प्रणाली के आनुवंशिक भार का विस्तार करने का प्रयास किया: EF-Tu (pEFTu), जो pLD प्रणाली में अनुपस्थित है, साथ ही राइबोसोमल आरएनए ऑपेरॉन * rrnB। prRNA एक अग्रदूत rRNA है जो 23S rRNA (राइबोसोमल आरएनए), 16S rRNA, 6S rRNA और tRNA (परिवहन RNA, इस मामले में Glu2) ( 2c ) को एनकोड करता है ।

ओपरोन * एककोशिकीय जीनोम की एक कार्यात्मक इकाई है, जिसमें जीन एन्कोडिंग प्रोटीन शामिल हैं।

प्लाज्मिड-विशिष्ट एम्पलीकॉन्स * को लक्षित करने वाले QPCR प्रयोगों ने पुष्टि की कि सभी छह प्लास्मिड (कुल डीएनए लंबाई 93 kb) की मोनोमेरिक इकाइयों को मूल संख्या ( 2c ) की तुलना में लगभग 2-8 बार दोहराया गया था ।

एम्प्लिकॉन * प्रवर्धन की एक अतिरिक्त इकाई है (डीएनए अनुभागों की नकल )।

संयुक्त प्लास्मिड प्रतिकृति की सफलता की अतिरिक्त पुष्टि, ज़ीओसिन (pREP), या केनामाइसिन (प्लास्मिड्स pLD और prRNA), या कार्बेनिसिलिन (pEFTu) के लिए प्रतिरोधी कालोनियों का निर्माण था। ये उपनिवेश DpnI ( 2d ) के साथ व्यवहार किए गए Purerep प्रतिक्रिया उत्पादों के परिवर्तन का परिणाम थे ।

चयनित 26 क्लोनल उपनिवेशों में प्रतिबंध विश्लेषण के बाद एक बार फिर सभी छह प्लास्मिड ( 2% ) के टीटीसीआरडी की सफलता की पुष्टि की गई ।

पहले वर्णित के समान विधि का उपयोग करते हुए, वैज्ञानिकों ने पांच अतिरिक्त प्लास्मिड्स के संयुक्त प्रतिकृति के लिए एक और प्रक्रिया को अंजाम दिया: क्रिएटिनिन किनेसे (pCKM), एडिलेट कराएंस (pAK1) और न्यूक्लियोसाइड डिपोस्फेट किनेज (pNDK) पर आधारित न्यूक्लियोसाइड ट्राइफॉस्फेट की न्यूनतम पुनर्जनन प्रणाली के लिए जीन; साथ ही T7 RNA पोलीमरेज़ (T7RNAP) और पायरोफॉस्फेटेज़ (pIPP)।

छवि संख्या 3

116.3 केबी के कुल आकार के साथ 11 प्लास्मिड्स का यह सेट पहुंचता है> अनुमानित जीनोम लंबाई का 100% एक न्यूनतम, आत्म-प्रतिकृति प्रणाली के लिए प्रस्तावित है जो केवल कम आणविक भार पोषक तत्वों ( 3 ए ) पर निर्भर करता है ।

वैज्ञानिकों ने तब जांचने का फैसला किया कि क्या प्रतिकृति के दौरान Purerep समानांतर जीन अभिव्यक्ति प्रदान कर सकता है। इसके लिए, तीन पीएलडी प्लास्मिड्स: पीएलडी 1, पीएलडी 2 और प्लीड 3 (पीईएफटीयू को शामिल नहीं) पर एफटी की बहुस्तरीय अभिव्यक्ति की जांच की गई।

इस बात की जांच करने के लिए कि क्या Purerep आम तौर पर इन प्लास्मिड से बहुस्तरीय अभिव्यक्ति का समर्थन करने में सक्षम है, BODIPY-Lys-tRNALys, जो अनुवाद उत्पादों के प्रतिदीप्ति लेबलिंग की उपस्थिति में प्रत्येक व्यक्ति प्लास्मिड से सेल-फ्री अभिव्यक्ति किया गया था।

डिटेक्शन सेंसिटिविटी को बेहतर बनाने और नए संश्लेषित प्रोटीन की मात्रा को सक्षम करने के लिए, स्थिर आइसोटोपिक लेबल का उपयोग करके मास स्पेक्ट्रोमेट्री के आधार पर प्रोटीन अभिव्यक्ति का एक मात्रात्मक विश्लेषण आगे किया गया था।

चित्र संख्या 4

इस विश्लेषण ने पीएलडी ( 4 ए ) द्वारा एन्कोड किए गए प्रोटीन के सभी एफटी सबयूनिट के संश्लेषण के लिए ठोस सबूत प्रदान किए । PLD2 और pLD3 दोनों में कूटबद्ध प्रोटीन का आंशिक या पूर्ण उत्थान भी देखा गया।

अभिव्यक्ति के विश्लेषण से पता चला कि pREP के साथ संयोजन में अनमॉडिफाइड Purerep में भी, PLD द्वारा एन्कोड किए गए 32 FT cidrons की पूरी प्रतिकृति है, और एन्कोडेड FT peptide चेन के लगभग आधे की अभिव्यक्ति है, जिनमें से संख्या प्रारंभिक से मेल खाती है या उससे अधिक है।

अध्ययन की बारीकियों के साथ एक अधिक विस्तृत परिचित के लिए, मैं अनुशंसा करता हूं कि आप वैज्ञानिकों की रिपोर्ट और इसके लिए अतिरिक्त सामग्रियों पर ध्यान दें।

उपसंहार

इस काम में, वैज्ञानिक यह हासिल करने में कामयाब रहे कि उनके कई सहयोगी पहले से केवल सपने में क्या कर सकते हैं - एक कृत्रिम प्रणाली का निर्माण करना जो आत्म-प्रतिकृति करने में सक्षम है।

अतिरंजित यह कहने का मतलब है कि वे एक ऐसी प्रणाली बनाने की दिशा में पहला कदम उठाने में सक्षम थे जो स्व-प्रजनन करेगी, जिससे जैविक प्रक्रियाओं का यथासंभव अनुकरण हो सके।

अध्ययन के लेखक भविष्य में अतिरिक्त डीएनए खंडों के साथ कृत्रिम जीनोम का विस्तार करने के परिणामों और योजना से बेहद प्रसन्न हैं। वे एक ऐसे शेल के साथ एक प्रणाली बनाना चाहते हैं जो पोषक तत्वों को अवशोषित करके और कचरे का निपटान करके व्यवहार्यता बनाए रख सके। इस तरह की एक कृत्रिम संरचना का उपयोग प्राकृतिक पदार्थों के लिए एक विशेष उत्पादन जैव-उपकरण के रूप में या और भी अधिक जटिल प्रणालियों को बनाने के लिए किया जा सकता है।

क्लोनिंग एक जटिल प्रक्रिया है, जिसमें कोई संदेह नहीं है, लेकिन एक पूर्ण, व्यवहार्य सिंथेटिक प्रणाली का निर्माण पूरी तरह से अलग स्तर है। कोई कहेगा कि इस तरह के अध्ययन खतरनाक हैं, क्योंकि किसी को भी माँ प्रकृति की जिम्मेदारियों को संभालने का अधिकार नहीं है। हालांकि, किसी व्यक्ति की जिज्ञासा को शांत करना लगभग असंभव है। सब कुछ समझने और सब कुछ दोहराने की हमारी इच्छा विज्ञान की प्रगति में ड्राइविंग कारकों में से एक है। बेहतर या बदतर के लिए, यह एक ऐसा प्रश्न है, जिसके लिए एक भी उत्तर नहीं है। हम केवल उज्ज्वल दिमाग की उपलब्धियों की प्रशंसा कर सकते हैं और एक यूटोपिया की उम्मीद करते हुए, भविष्य की ओर ध्यान से देख सकते हैं।

आपका ध्यान के लिए धन्यवाद, जिज्ञासु बने रहें और हर किसी के लिए एक शानदार सप्ताहांत हो, दोस्तों! :)

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