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Coin par coin: utilisation du virus PIV5 pour créer un vaccin contre le MERS-CoV et éventuellement contre le SRAS-CoV-2



Compte tenu des circonstances actuelles, il n'est pas du tout surprenant que la communauté scientifique ait concentré toutes ses forces sur la recherche et le développement de méthodes et d'outils pour lutter contre la propagation du virus. Aujourd'hui, nous examinons une étude dans laquelle des scientifiques de l'American Society for Microbiology (ASM) décrivent un vaccin très efficace contre le virus MERS, qui a commencé à se répandre en 2012. Selon les scientifiques, leur développement peut aider à créer un vaccin contre le SRAS-CoV-2 qui fait actuellement rage. Quelle est la particularité du vaccin créé, à partir duquel il a été créé, et dans quelle mesure accomplit-il efficacement sa tâche? Nous en apprenons sur le rapport des scientifiques. Aller.

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Base d'étude


Le MERS ou le syndrome respiratoire du Moyen-Orient est une maladie inflammatoire des organes respiratoires qui se développe en raison d'une infection par le virus du genre Betacoronavirus de la sous-famille désormais connue Coronavirinae.


Instantané de MERS-CoV (jaune).

La source du virus MERS-CoV est encore une fois les chauves-souris. Les premiers cas d'infection parmi les personnes ont été enregistrés en 2012 sur le territoire de la péninsule arabique, mais en 2015, le virus avait atteint les pays d'Asie de l'Est et d'Europe. Selon les dernières données, le nombre de cas confirmés d'infection à MERS-CoV est de 2494 personnes, dont 858 sont décédées (données du 02.02.2020). Les données varient d'une source à l'autre, mais il est clair que le degré de distribution dans le MERS-CoV n'est pas aussi élevé que dans le SRAS-CoV-2. Néanmoins, le virus du Moyen-Orient a également un taux de mortalité assez élevé - environ 35%. Cet indicateur est le plus inquiétant.

MERS-CoV est un virus à ARN à chaîne positive * , dans lequel la pénétration dans les cellules cibles est réalisée grâce à la protéine Senveloppe virale * .
Virus à ARN à chaîne positive * - ARN viral positif. Cela implique qu'une séquence d'ARN viral particulière peut être directement traduite en protéines virales (par exemple, des protéines nécessaires à la réplication du virus). Par conséquent, dans les virus à ARN avec une chaîne positive, le gène d'ARN viral peut être considéré comme un ARNm viral (ARN messager) et il peut être immédiatement traduit par la cellule hôte.
Enveloppe virale * - une enveloppe supplémentaire couvrant l'enveloppe extérieure (capside) de nombreux virus.
La protéine S se compose de la sous-unité S1 responsable de la liaison au récepteur du virus, la dipeptidyl peptidase 4 (DPP4 ou CD26) via le domaine de liaison au récepteur (RBD du domaine de liaison au récepteur ), ainsi que de la sous-unité S2, qui assure la fusion de la membrane.

Les chercheurs rappellent qu'à l'heure actuelle il n'y a pas de vaccin contre le MERS-CoV, il n'y a qu'un certain nombre de développements dont l'efficacité est assez douteuse. Les scientifiques pensent que leur travail va changer cette situation.

Dans cette étude, les scientifiques ont décidé de tourner leur attention vers un autre virus - PIV5. Les virus PIV ou parainfluenza (PG) ont cinq variétés, dont trois provoquent des maladies chez l'homme (de PG-1 à PG-3) et deux qui ne sont pas dangereuses pour l'homme (PG-4 et PG-5).


Instantané TEM du virus parainfluenza.

PG-5 est un membre du genre Rubulavirus de la famille des Paramyxoviridae, qui comprend le virus des oreillons (MuV ou «oreillons») et le virus de la parainfluenza humaine de type 2 (PG-2) et de type 4 (PG-4). PG-5 code pour huit protéines virales connues. La protéine nucléocapside (NP), la phosphoprotéine (P) et la protéine ARN polymérase (L) sont importantes pour la transcription * et la réplication * du génome de l'ARN viral.
Transcription * - le processus de synthèse d'ARN utilisant l'ADN comme modèle; transfert d'informations génétiques de l'ADN à l'ARN.
La réplication * est le processus de création de deux molécules d'ADN fille basées sur l'ADN parental.
Les scientifiques pensent que le PG-5 est un excellent candidat pour les vecteurs viraux * pour le futur vaccin. Le PG-5 est assez sûr, malgré son degré élevé d'infectiosité, qui peut jouer dans les mains lors de la création d'un vaccin efficace.
Les vecteurs viraux * sont des outils pour fournir du matériel génétique aux cellules cibles.
De plus, PG-5 n'a pas de phase d'ADN dans son cycle de vie, ce qui évite d'éventuelles modifications génétiques involontaires de l'ADN de la cellule hôte par recombinaison ou insertion. De plus, la structure de PG-5 est assez stable, contrairement aux virus à ARN avec une chaîne positive. La confirmation de cela est le PG-5 recombinant créé exprimant le gène F pour le virus respiratoire syncytial, lorsque le gène F a été maintenu pendant plus de 10 générations.

Un autre avantage de PG-5 est son rapport coût-efficacité, car ce virus peut être cultivé jusqu'à 8x10 8 PFU / ml (PFU - unités de formation de plaques).

Auparavant, le PG-5 était déjà utilisé comme vecteur viral lorsque l'on travaillait avec des vaccins contre le virus respiratoire syncytial et la rage. Au cours d'expériences sur des souris, il a été constaté que le vecteur PG-5 exprimant la NA (neuraminidase, qui fait partie de la membrane) du virus de la grippe, conduit à une immunisation complète des sujets expérimentaux, à savoir 4 jours après l'infection, il n'y a eu aucun cas de décès ni même d'infection. Mais PG-5, exprimant NP (nucléoprotéine), protège 100% des souris expérimentales contre la souche létale du virus de la grippe H1N1.

Sur la base de ces résultats positifs d'études antérieures, les scientifiques ont décidé d'utiliser PG-5 comme vecteur viral exprimant la protéine S du virus MERS. Comme précédemment, toutes les expériences ont été réalisées sur des souris.

Résultats de recherche


Les chercheurs ont introduit au préalable le gène HA (hémagglutinine) du virus de la grippe A à différents endroits du génome PG-5 et ont découvert que les inserts en SH (petit hydrophobe) et HN (hémagglutinine-neuraminidase) donnent une meilleure réponse immunitaire.
L'hémagglutinine et la neuraminidase du virus de la grippe sont des antigènes de surface du virus qui permettent de se fixer aux cellules cibles.
Compte tenu de cela, il a été décidé d'introduire le gène S de taille réelle du virus MERS à l'intersection de SH et HN. Un plasmide * contenant l' ADNc de pleine longueur * PG-5 avec un gène S inséré à la jonction de SH et HN a été construit en utilisant des méthodes de clonage moléculaire standard ( 1A ).


Image n ° 1
Le plasmide * est une petite molécule d'ADN qui est séparée des chromosomes et capable d'une réplication indépendante.
ADNc * - ADN complémentaire, c'est-à-dire ADN synthétisé sur une matrice d'ARNm mature (ARN messager) dans une réaction catalysée par la transcriptase inverse.
Le plasmide a été transfecté * dans des cellules BHK * avec des plasmides exprimant l'ARN polymérase TG, NP, P et L du virus PG-5 (PIV5).
Transfection * - l'introduction d'acide nucléique dans les cellules par une méthode non virale.
Les cellules BHK * ( rein de bébé hamster ) sont des cellules du tissu conjonctif (fibroblastes) des reins de hamster qui sont sensibles à de nombreux virus qui affectent les humains. Les cellules BHK sont utilisées pour la transformation, ainsi que pour les transfections stables et transitoires.
En conséquence, le virus infectieux PIV5-MERS-S a été obtenu, qui a ensuite été purifié et multiplié en grand nombre dans des cellules MDBK * pour une analyse plus approfondie.
Cellules MDBK * ( cellules rénales canines Madin-Darby ) - cellules rénales de chien, isolées pour la première fois en 1958 par les scientifiques SH Madin et NB Darby. Ces cellules sont utilisées en recherche comme cellules de mammifères modèles.
Le génome du virus a été séquencé et a confirmé qu'il contient la séquence d'ADN d'entrée souhaitée. Ensuite, il a fallu vérifier l'expression de la protéine S dans les cellules infectées par PIV5-MERS-S. Pour cela, les cellules ont été infectées à différentes valeurs de MOI * , après quoi elles ont été lysées (dissoutes) pour immunotransfert * en utilisant un anticorps anti-S.
MOI * ( multiplicité d'infection ) - la multiplicité d'infection, c'est-à-dire le rapport des agents (virus) aux cibles d'infection (cellules).
L'immunoempreinte * est une méthode très sensible pour la détection des protéines, basée sur une combinaison d'électrophorèse et d'immunodosage enzymatique ou d'analyse radio-immune.
L'analyse a montré la présence à la fois de la protéine S complète et des fragments S2, ce qui indique le succès de sa mise en œuvre ( 1B ). L'expression de la protéine S dans les cellules infectées par PIV5-MERS-S a été en outre confirmée par analyse d'immunofluorescence ( 1C ).

Les scientifiques notent que PIV5-MERS-S a provoqué une formation massive de syncytium * dans les cellules Vero * . De plus, la cinétique de croissance du PIV5-MERS-S et du PG-5 conventionnel (PIV5) était très similaire ( 1D ).
Le syncytium * est un type de tissu dans lequel les cellules ne sont pas complètement séparées, c'est-à-dire il existe des sections de cytoplasme avec des noyaux interconnectés par des plasmodesmes (ponts cytoplasmiques).
Vero* — , .


Image n ° 2

Immunisation PIV5-MERS-S génère des anticorps neutralisants et une immunité à médiation par les lymphocytes T. Pour déterminer si PIV5-MERS-S peut générer des réponses immunitaires, les souris ont été immunisées avec une seule dose de PIV5-MERS-S ou un contrôle du virus PIV5-GFP à 10 4 PFU ou 10 6 PFU par individu via la voie intranasale.

Alors que les deux doses ont provoqué des réponses en anticorps, les titres neutralisants étaient modestes à 1:64 et 1: 128 pour 10 4 et 10 6 doses, respectivement ( 2A et 2B ).

Les scientifiques se souviennent que les souris des espèces C57BL / 6 et BALB / c après immunisation génèrent des réponses immunitaires à dominante Th1 et Th2, respectivement.
Th (T-helpers) - lymphocytes T qui améliorent la réponse immunitaire adaptative (immunité acquise).

Th1 - favorise le développement d'une réponse immunitaire cellulaire en activant les macrophages.

Th2 - active les lymphocytes B, ce qui aide au développement d'une réponse immunitaire humorale.
Une dose de PIV5-MERS-S (10 6 PFU) a entraîné un titre d'anticorps neutralisants jusqu'à 1: 2000 chez les souris BALB / c ( 2C ), ce qui correspond à la réponse dominante Th2 chez les souris de cette espèce.

Pour évaluer la réponse primaire des cellules T CD8 * générées par immunisation avec PIV5-MERS-S, les souris hDPP4-KI ont été immunisées par voie intranasale avec PIV5-MERS-S (10 4 PFU).
CD8* ( 8) — , - .
Quatre semaines plus tard, une clôture a été prise pour examiner la présence / absence de cellules T CD8 résidentes pulmonaires spécifiques au MERS-CoV ( 3A ).


Image n ° 3

Comme le montre la figure 3B - 3D , il y a eu une augmentation significative du pourcentage et du nombre total de cellules CD8-IFN dans les poumons des souris immunisées avec PIV5-MERS par rapport à celles infectées avec PIV5-GFP.

Pour évaluer la réponse des cellules T CD8 spécifiques du MERS-S, une injection supplémentaire de MERS-CoV MA a été réalisée (10 4 PFU). En conséquence, une augmentation significative de la réponse des lymphocytes T CD8 le quatrième jour a été observée par rapport aux souris infectées par le contrôle PIV5-GFP ( 3E - 3G)

Une augmentation de 10 fois des lymphocytes T CD8 spécifiques du MERS-S a également été observée par rapport à la réponse primaire des lymphocytes T CD8 ( 3B - 3G ).


Image n ° 4

Grâce à l'immunisation PIV5-MERS-S prévient la mort de l'infection chez la souris. Pour déterminer l'efficacité de PIV5-MERS-S dans la prévention ou la modification du virus MERS-CoV, les souris hDPP4 KI ont été immunisées avec le PIV5-MERS-S (10 4 PFU) par voie intranasale.

4 semaines après l'immunisation, les souris ont été infectées avec du MERS-S modifié pour être plus actives chez la souris ( 4A ). Toutes les souris immunisées avec PIV5-MERS-S ont survécu à cette infection mortelle, avec une légère perte de poids ( 4B et4C ). En revanche, toutes les souris infectées par le contrôle PIV5-GFP ou PBS sont mortes après l'infection. Cela indique que PIV5-MERS-S a complètement protégé les souris contre une infection mortelle.

Malgré le fait que les souris immunisées PIV5-MERS-S avaient un taux plus élevé de clairance pulmonaire du virus, cette méthode n'a pas fourni une immunité stérilisante complète ( 4D ).


Image n ° 5

Les études histopathologiques des poumons après infection ont montré que les souris immunisées avec PIV5-MERS-S avaient significativement moins de débris cellulaires * et plus d'infiltrats mononucléaires ( 5A et 5B ).
Les débris cellulaires * sont le reste de la cellule entouré d'une membrane plasmique phagocytée par les macrophages.
Une forte infiltration de leucocytes (principalement des cellules mononucléaires) et moins de dommages (œdème, membranes hyalines, débris de cellules nécrotiques, etc.) ont également été détectés.

Au stade final de l'étude, les scientifiques ont évalué les réponses protectrices induites par le PIV5-MERS-S ou le MERS-CoV inactivé. Pour cela, certaines souris ont été immunisées avec du PIV5-MERS-S (10 4 PFU) ou du PBS, tandis que d'autres ont été immunisées avec du MERS-CoV inactivé aux UV.

Alors que PIV5-MERS-S offrait une protection à 100% contre les infections mortelles, le MERS-CoV inactivé ne protégeait que 25% des souris (image ci-dessous).


Image n ° 6

Ensuite, une étude a été réalisée sur les poumons de souris qui ont d'abord été immunisées puis infectées par MERS-CoV (image ci-dessous).


Image n ° 7

Plus d'éosinophiles (un type de globule blanc) ont été observés dans les poumons chez des souris immunisées avec du MERS-CoV inactivé que chez des souris immunisées avec du PBS ou du PIV5-MERS-S après infection par MERSCoV.

Comparé au PBS, l'infiltration éosinophile périvasculaire a été significativement augmentée dans le groupe MERS-CoV inactivé, mais aucune différence statistique n'a été observée par rapport au groupe immunisé avec PIV5-MERS-S.

Une évaluation a également été faite de la formation d'une membrane hyaline dans les alvéoles pulmonaires, qui est un signe clair de maladie pulmonaire sévère. Par rapport au groupe PBS, les souris immunisées avec PIV5-MERS-S ont montré une protection significative contre la formation de membrane hyaline. Mais les souris immunisées avec du MERS-CoV inactivé n'ont montré qu'une légère diminution de la formation de la membrane hyaline, ce qui indique la faible efficacité de cette méthode d'immunisation par rapport au PIV5-MERS-S.

Pour une connaissance plus détaillée des nuances de l'étude, je vous recommande de consulter le rapport des scientifiques .

Épilogue


Dans ce travail, les scientifiques ont pu démontrer une méthode très efficace d'immunisation des souris avec le virus MERS-CoV, qui marche librement sur notre planète depuis 2012.

La principale caractéristique distinctive de la méthode développée est l'utilisation d'un autre virus, à savoir le PG-5, comme vecteur viral. En d'autres termes, le coin est éliminé par le coin.

L'utilisation du virus comme moyen de transport pour la délivrance des gènes nécessaires à la vaccination peut être considérée comme une méthode assez inhabituelle, mais elle peut contribuer à une lutte plus efficace contre les virus. Les chercheurs eux-mêmes affirment que leurs travaux visent non seulement à lutter contre le MERS-CoV, mais aussi avec le SRAS-CoV-2 (COVID-19). Les deux virus appartiennent à la même sous-famille, ont des voies d'infection et des effets similaires sur les cellules cibles. Si la méthode d'immunisation développée est développée, il peut être possible de créer un vaccin suffisamment efficace.

C'est ce que les auteurs de ce travail envisagent de faire à l'avenir. Qu'ils réussissent ou non à créer un super vaccin, le temps nous le dira. Cependant, ils méritent maintenant tous les éloges, du moins pour avoir prêté attention au virus, que tout le monde semblait oublier.

Quoi qu'il en soit, nous ne pouvons qu'espérer que la science et toutes les personnes impliquées, comme plusieurs fois auparavant, seront capables de surmonter tous les préjugés et les peurs, de surmonter tous les obstacles et de montrer que la pensée analytique, basée sur la connaissance et la logique, est toujours capable trouver un moyen de sortir de toute situation actuelle, aussi terrible soit-elle à première vue.

Merci de votre attention, restez curieux et bonne semaine de travail, les gars.

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