👨‍🏭 😖 ⛎ Analyse des données ChIP-seq: des histones aux tâches informatiques 🛍️ 💭 👳

Chaque année, l' Institut de bioinformatique de Saint-Pétersbourg et de Moscou recrute des biologistes, des mathématiciens et des programmeurs pour s'immerger dans le monde de la bioinformatique. Les biologistes apprennent à programmer et à s'entraîner à mettre en œuvre des idées dans le code, et les informaticiens étudient la biologie et appliquent des approches algorithmiques aux problèmes biologiques et médicaux. La partie la plus importante de la formation est constituée de vrais projets scientifiques. Dans cet article, nous parlerons du travail et des résultats des étudiants de l'Institut, réalisés sous la direction d'Oleg Shpynov de JetBrains Research en 2019. Le projet est consacré à l'étude des changements de la chromatine humaine à l'aide de l'apprentissage automatique.

Étudiants en informatique 2019 Institute of Bioinformatics

Qu'est-ce que le séquençage et pourquoi est-il nécessaire

Le désir de satisfaire la curiosité et de se comprendre, qui a commencé par une description de l'anatomie humaine, s'est progressivement approfondi et est passé à un niveau plus détaillé. Les cellules sanguines et leur interaction avec les parasites, les mécanismes de transmission des informations héréditaires et la formation de métastases par les cellules cancéreuses ont été étudiés.

L'avènement des technologies de séquençage nous a permis d'aller plus loin et de regarder directement «en face» du vecteur de l'information génétique - l'ADN. En d'autres termes, l'acide désoxyribonucléique, qui est situé dans le noyau de presque toutes les cellules de notre corps, est responsable de notre apparence, de notre taille, du timbre de notre voix et de la possibilité de contracter le paludisme. Cependant, la technologie, comme les méthodes biochimiques, ne s'arrête pas. Leur combinaison a permis de "mettre en lumière" des mécanismes plus complexes du corps. Voyons cela plus en détail.

Comment séquencer les organismes

Les technologies de séquençage ont changé, et le progrès technologique permet désormais, selon les souhaits, de séquencer des cellules individuelles, d'en observer les changements dans le temps ou simplement d'obtenir des informations complètes sur la séquence du vecteur d'information héréditaire - l'ADN. En fait, le séquençage vous permet de traduire une molécule biologique dans un fichier texte, avec lequel vous pouvez ensuite travailler en texte brut. Les méthodes de séquençage modernes utilisent l'approche du «fusil de chasse» et produisent un grand nombre de courts fragments. Dans certaines analyses, ces courts fragments sont «essayés» sur des génomes existants et examinent les différences dans la séquence du «texte».

Que sont les histones et qu'affectent-elles

Le brin d'ADN est très long et ne peut pas être en permanence dans un état sans torsion - il est gênant et dangereux (il y a une plus grande probabilité de trou quelque part). Par conséquent, la molécule spirale (se tord très fortement) et est compacte, enveloppée dans des complexes protéiques spéciaux, comme les cheveux sur les bigoudis. Ces protéines sont appelées nucléosomes et sont composées de protéines histones. La modification des histones est un exemple d'un mécanisme plus général de régulation épigénétique. L'organisme est vivant et doit répondre aux changements environnants. La réaction du corps comprend le changement dans l'expression des gènes. Si le fragment d'ADN sur lequel se trouve le gène est étroitement emballé et enroulé sur le nucléosome, il est impossible de s'y rendre et de lire les informations. Par conséquent, des groupes spéciaux de phosphoryle et d'acétyle sont accrochés aux histones,ce qu'on appelle la phosphorylation ou l'acétylation se produit. Cela provoque le déplacement de l'histone et donne accès au fragment d'ADN souhaité. Mais le nucléosome reste lié à l'ADN et cela peut être utilisé dans des études réglementaires.

Le mécanisme d'acétylation et de méthylation des histones ( source )

Séquençage d'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP-seq) et son utilisation

Pour étudier les fragments d'ADN qui restent liés à la protéine, il existe une méthode spéciale: l'immunoprécipitation de la chromatine (immunoprécipitation de la chromatine, ChIP). Cette analyse se déroule comme suit:

réticulation réversible entre l'ADN et ses protéines en interaction (généralement par traitement au formaldéhyde)
Isolement et fragmentation de l'ADN par ultrasons ou endonucléases
dépôt d'anticorps spécifiques aux protéines
la destruction des liaisons croisées entre la protéine et l'ADN, la purification de l'ADN

En bref, nous retirons la protéine liée à l'ADN de la solution et la faisons «lâcher» l'ADN. D'un point de vue biologique, le champ d'action est compréhensible: l'étude de l'expression des gènes, les zones fermées et ouvertes, etc. Nous parlerons des choses que les programmeurs peuvent faire dans cette tâche ci-dessous.

Dans le cas du séquençage ChIP (-seq), les fragments d'ADN résultants sont amplifiés (duplication artificielle de fragments) et séquencés. Ensemble de séquences de petits morceaux d'ADN et étude de la bioinformatique.

Les données reçues passent le contrôle de qualité, sont filtrées, alignées sur une séquence d'ADN et traitées par des programmes spéciaux.

Schéma de préparation d'ADN pour l'analyse

La tâche de recherche de sites de liaison à l'ADN est souvent appelée tâche d'appel de pointe, et la classe d'outils est celle des appelants de pointe. À l'heure actuelle, il existe de nombreuses approches et outils informatiques pour analyser ces données, mais les algorithmes ne sont pas idéaux et présentent un certain nombre de limites. Il existe encore de nombreux problèmes informatiques non résolus pour les programmeurs et les informaticiens dans ce domaine.

Voici certains d'entre eux que les étudiants de spécialités mathématiques et techniques sont en train de résoudre:

Fragmentation et contrôle inégaux

La disponibilité de la chromatine pendant la fragmentation n'est pas la même dans différentes parties du génome: elle est plus accessible dans les régions activement transcrites, par conséquent, les fragments d'ADN correspondants prévaudront dans l'échantillon, ce qui peut conduire à un résultat faussement positif. En revanche, les zones très compactes peuvent être moins susceptibles de se fragmenter et donc d'être moins représentées dans l'échantillon, ce qui peut conduire à un résultat faussement négatif.

Nombre de cellules

La technique classique a un certain nombre de limites. Ainsi, généralement un nombre important de cellules (environ 10 millions) sont nécessaires pour ChIP-seq, ce qui complique l'application de cette méthode sur les petits organismes (tels que les champignons ou les protozoaires), et limite également le nombre d'expériences pouvant être effectuées avec un échantillon précieux.

Bruit de données

Au cours de l'expérience ChIP-seq, il est possible d'obtenir dans la bibliothèque finale non seulement des fragments d'ADN associés à la protéine, mais également d'autres fragments non spécifiquement liés. Cela peut se produire en raison de la spécificité non idéale de l'anticorps, des problèmes de lavage des fragments d'ADN libres, etc. Ces fragments forment le soi-disant bruit dans les données. Le problème réside non seulement dans l'existence du bruit, mais aussi dans la complexité de sa mesure. Pour évaluer son niveau, il existe une métrique du rapport signal / bruit (SNR), qui est déterminée par le nombre et la puissance des pics obtenus pour chaque échantillon. Cependant, un SNR élevé ne garantit pas la détermination correcte des sites de liaison, mais reflète simplement la présence d'un grand nombre de régions du génome,qui sont alignés (sur le chromosome à cet endroit la séquence coïncide avec le désiré) de nombreuses lectures - de petits fragments d'ADN.

Options de résolution de problèmes

Une partie de ces tâches a été résolue par des étudiants de l'Institut de bioinformatique sous la direction d'Oleg Shpynov de JetBrains Research dans le cadre de projets de recherche semestriels.
Appel de pointe bruyant.
étudiant: Chaplygina Daria

Dans l'article «Impact de la profondeur de séquençage dans les expériences ChIP-seq» (1), les auteurs ont étudié l'effet de la taille de la bibliothèque (le nombre de lectures initiales) sur les résultats des algorithmes de recherche de pics. Ils ont créé des jeux de données artificiels pour différents types de modifications des histones par échantillonnage aléatoire à partir d'expériences réelles. Comme prévu, plus la bibliothèque est pauvre, plus il est difficile pour les algorithmes de trouver des pics, les résultats sont incohérents entre les différentes méthodes. Mais ils ont également remarqué que, dans le cas de l'utilisation du même outil, la coordination entre les répliques biologiques est perdue. Dans un projet de semestre, nous avons étudié l'effet du bruit dans les données sources.

L'ensemble de données avec un niveau de bruit contrôlé a été obtenu sur la base des données accessibles au public des expériences ChIP-seq du site du projet ENCODEProjet ENCODE . Pour cela, deux modèles de bruit ont été utilisés:

Modèle additif. Des fragments de coupes aléatoires d'ADN ont été ajoutés au fichier source avec des «données propres». La proportion de fragments aléatoires variait de 0% à 90%.
Modèle probabiliste. Pour chaque expérience, un modèle mathématique a été construit à l'aide de l'outil Tulip. Avec son aide, une expérience complètement nouvelle a été générée, dont l'un des paramètres - le pourcentage de fragments situés à l'intérieur des sites de liaison ADN-protéine - variait de 10% à 0,5%.

Modèle probabiliste. Pour chaque expérience, un modèle mathématique a été construit à l'aide de l'outil Tulip. Avec son aide, une expérience complètement nouvelle a été générée, dont l'un des paramètres - le pourcentage de fragments situés à l'intérieur des sites de liaison ADN-protéine - variait de 10% à 0,5%.

Visualisation des changements de données lors de l'application d'un modèle de bruit probabiliste

Sur l'ensemble de données obtenu, nous avons analysé trois algorithmes: MACS2 (2), SICER (3) et SPAN (un algorithme développé par JetBrains Research. Il est basé sur des semi-supervisésméthode d'apprentissage automatique). Comme il s'est avéré, avec un SNR fixe, on peut prédire la précision et l'exhaustivité attendues de l'ensemble des pics qui seront trouvés par l'algorithme. À un niveau de bruit élevé (ou faible SNR): MACS2 et SICER ne trouvent presque pas de pics, tandis que SPAN affiche les résultats les plus stables en termes de combinaison d'indicateurs.

Précision et exhaustivité des algorithmes de recherche de crête dans un niveau de bruit contrôlé

Nous avons étudié comment, dans le processus de bruit, deux métriques de changement de qualité des données: SNR et pourcentage de fragments dans les pics (FRIP - Fraction of Reads In Peaks). Les mesures ont montré que pour le même SNR, la fraction de fragments par région d'interaction ADN - protéine peut varier de manière significative (dans certains cas, la différence était jusqu'à 50%). Les normes et recommandations existantes pour évaluer la qualité de ces expériences ChIP-seq sont incomplètes et de nouvelles approches intégrées sont nécessaires.
Dans le cadre des travaux, nous avons également développé des pipelines pour la conduite semi-automatique de telles expériences.

Implémentation d'approches et de code source:

github.com/DaryaChaplygina/NoisyPeakCalling ,

github.com/DaryaChaplygina/NoisyPeakCalling2 .

Apprendre en profondeur à la rescousse!
étudiante: Daria Balashova

L'une des limites de la méthode classique ChIP-seq est la grande quantité de matériel cellulaire nécessaire, qui ne permet pas l'expérience, par exemple, dans le cas de populations de cellules rares ou dans le cas de plusieurs mesures pour un échantillon biologique. La nouvelle méthode Chip-seq (4) Ultra-Low-Input (ULI) nécessite beaucoup moins de matériel - 100 000 cellules sont suffisantes - mais présente une plus grande variabilité et niveau de bruit dans les données.

L'utilisation de méthodes d'apprentissage machine approfondies gagne en popularité en bioinformatique, démontrant d'excellents résultats dans la résolution de problèmes tels que le traitement d'images biomédicales. Dans l'ouvrage «Débruitage des histones à l'échelle du génome ChIP-seq avec des réseaux de neurones convolutifs» (5), les auteurs ont proposé un algorithmeCoda est une méthode d'amélioration de la qualité des données ChIP-seq basée sur des réseaux de neurones convolutifs. Ils ont créé et formé un réseau neuronal profond non seulement pour améliorer les données de mauvaise qualité, mais aussi pour y trouver des pics.

Dans le cadre de ce projet, l'algorithme original a été adapté pour les données ULI ChIP-seq. En utilisant les résultats du projet précédent et les données ULI ChIP-seq de l'article «Changements épigénétiques dans les monocytes humains vieillissants» (6), nous avons analysé des caractéristiques importantes de l'algorithme telles que l'amélioration des paramètres de qualité, par exemple, le SNR. En conséquence, l'algorithme DCNN a été créé . - réseau neuronal convolutif pour améliorer automatiquement la qualité des données en fonction du rapport signal / bruit en cas de répétitions biologiques. Si l'amélioration et la purification du signal fonctionnent assez bien, la recherche de sites de liaison des protéines avec l'ADN en utilisant des méthodes d'apprentissage en profondeur n'est toujours pas résolue, car les approches existantes nécessitent un échantillon d'apprentissage de grande taille et de haute qualité.

Représentation schématique de l'application du réseau neuronal convolutif DCNN

Implémentation de l'approche et du code source: github.com/dashabalashova/Denoising_CNN .

Au lieu d'une postface

La bioinformatique vous permet d'appliquer les approches des programmeurs aux données biologiques et d'acquérir de nouvelles connaissances qui aideront les biologistes et les médecins à étudier les humains. Maintenant ouvert accepte les candidatures pour l' école d'été 2020 , qui se tiendra à Saint-Pétersbourg du 27 juillet au 1er août. Il est idéal pour explorer la bioinformatique.

Pour ceux qui ont décidé d'une formation plus sérieuse - il y a une chance de sauter dans la dernière voiture et de postuler à un programme de recyclage en bioinformatique à Saint-Pétersbourg et à Moscou jusqu'au 22 février ou jusqu'au 1er mars au séminaire de retraite sur la biologie des systèmes .

Pour ceux qui aiment lire et découvrir de nouvelles choses, nous avons une liste de livres et de manuels sur les algorithmes, la programmation, la génétique et la biologie.

Bibliographie:

Jung, Y. L., Luquette, L. J., Ho, J. W., Ferrari, F., Tolstorukov, M., Minoda, A.,… & Park, P. J. (2014). Impact of sequencing depth in ChIP-seq experiments. Nucleic acids research, 42(9), e74-e74.
Zhang, Y., Liu, T., Meyer, C. A., Eeckhoute, J., Johnson, D. S., Bernstein, B. E.,… & Liu, X. S. (2008). Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome biology, 9(9), R137.
Xu, S., Grullon, S., Ge, K., & Peng, W. (2014). Spatial clustering for identification of ChIP-enriched regions (SICER) to map regions of histone methylation patterns in embryonic stem cells. In Stem Cell Transcriptional Networks (pp. 97-111). Humana Press, New York, NY.
Brind'Amour, J., Liu, S., Hudson, M., Chen, C., Karimi, MM, & Lorincz, MC (2015). Un protocole ChIP-seq natif à entrée ultra-faible pour le profilage à l'échelle du génome de populations de cellules rares. Communications sur la nature, 6 (1), 1-8.
Koh, PW, Pierson, E. et Kundaje, A. (2017). Débruitage de l'histone à l'échelle du génome ChIP-seq avec des réseaux de neurones convolutionnels. Bioinformatics, 33 (14), i225-i233.
Schukina, Bagaitkar, Shpynov et al., In review, artyomovlab.wustl.edu/aging

Auteurs de l'article:
Olga Bondareva, Institut de bioinformatique
Oleg Shpinov , JetBrains Research
Ekaterina Vyakhhi , Institut de bioinformatique

Analyse des données ChIP-seq: des histones aux tâches informatiques