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«Regardez, c'est quelque chose»: auto-réplication de l'ADN artificiel



L'une des principales caractéristiques distinctives de tout organisme vivant est la capacité de sauvegarder et de reproduire les informations nécessaires pour créer leur propre espèce. Cela se manifeste principalement dans la réplication de l'ADN, lorsqu'une paire de filles apparaît à partir du même ADN parent, qui est une copie exacte de leur progéniteur. Dans la nature, ce processus est observé partout, mais il est extrêmement difficile de le recréer dans des conditions de laboratoire à partir de zéro, cependant, il est assez réaliste.

Scientifiques de l'Institut de biochimie. Max Planck (Allemagne) a réussi à créer un système biologique capable de reproduire son propre ADN. Quelles techniques ont été utilisées pour créer de l'ADN de réplication synthétique, quelle est l'efficacité du système résultant et que signifie cette découverte pour la biologie synthétique moderne? Nous trouverons des réponses à ces questions dans le rapport des scientifiques. Aller.

Base d'Ă©tude


Dans le domaine de la création de systèmes biologiques artificiels, la capacité de se reproduire est un aspect clé de l'utilité du système créé. Selon les scientifiques, cela peut être réalisé grâce à la mise en œuvre des composants de base: réplication * , transcription * et traduction d' ADN * .
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En d'autres termes, afin de créer une vie artificielle à part entière, il est nécessaire de mettre en œuvre une reproduction auto-codée, c'est-à-dire auto-réplication. Il s'agit d'un processus extrêmement compliqué et déroutant.

Les auteurs de l'étude notent que dans les systèmes basés sur la biochimie existante, par exemple les MPC ( cellules à base de protéines minimales) , l'auto-réplication nécessite une refonte complète de la biologie moléculaire, y compris la réplication, la transcription et la traduction de l'ADN, en tenant compte d'un environnement totalement sans cellules.

La synthèse des protéines à partir de l'ADN peut être réalisée dans certains systèmes recombinants basés sur les ARN polymérases du phage * - les principales parties du mécanisme de traduction d'Escherichia coli et le système de régénération énergétique minimale, c'est-à-dire PURE - Synthèse de protéines à l'aide d'éléments recombinants (synthèse protéique utilisant des éléments recombinants).
Les bactériophages ou phages * sont des virus qui infectent sélectivement les cellules bactériennes et archéennes. En biologie, il est utilisé comme vecteur (ADN pour le transfert de matériel génétique dans la cellule).
Parallèlement, il reste extrêmement difficile de recréer le processus de réplication de l'ADN du génome basé sur la transcription et la traduction (TTcDR - transcription - réplication de l'ADN couplé à la traduction ), qui code pour tous les composants macromoléculaires du système PURE à l'aide d'un réplicome auto-encodé * .
Replisoma * est un complexe multi-protéique qui réplique l'ADN bactérien.
La réplication de l'ADN basée sur les ADN polymérases (DNAP) des phages (par exemple, Phi29) peut aider à mettre en œuvre la technique TTcDR.

Cependant, dans la méthode TTcDR, le génome Phi29 de taille réelle ne pouvait être atteint qu'en bloquant certains des facteurs de réplication.

Toutes les méthodes ci-dessus ont leurs avantages théoriques, mais en pratique, elles n'ont pas donné un résultat complet. Dans les travaux que nous envisageons aujourd'hui, les scientifiques décrivent un système de traduction qui assure la réplication et l'expression auto-codées de grands génomes d'ADN dans des conditions bien définies sans cellules. En particulier, une auto-réplication du génome de plus de 116 kb a été réalisée. (milliers de paires de nucléotides), couvrant la gamme complète des facteurs de traduction Escherichia coli(Escherichia coli), les trois ARN ribosomaux, le système de régénération énergétique, ainsi que les ARN et ADN polymérases * .
La polymérase * est une enzyme qui effectue la synthèse de polymères d'acides nucléiques. L'ADN polymérase synthétise l'ADN et l'ARN polymérase synthétise l'ARN. Ce processus passe par la copie complémentaire de l'ADN ou de l'ARN parental.
De plus, le système créé a démontré sa capacité à synthétiser plus de 30 facteurs de traduction, dont la moitié s'exprime en quantités égales ou supérieures à celles d'introduction.

RĂ©sultats de recherche


À la première étape, les scientifiques ont testé le TTcDR dépendant de Phi29-DNAP auto-encodé en utilisant le protocole standard du système PURExpress .

La région codante Phi29-DNAP flanquée du promoteur * T7 a d' abord été clonée dans le vecteur pCR-Blunt TOPO (pREP, 1a ).
Le promoteur * est une séquence nucléotidique d'ADN utilisée par l'ARN polymérase comme région d'initiation de la transcription.


Image n ° 1

En théorie, cette architecture devrait permettre la réplication spontanée de l'ARN sous la forme d'un anneau roulant * en utilisant du DNAP auto-codé sans protéines de réplication supplémentaires ou amorces d'ADN fournies en externe.
La réplication de type à anneau roulant * est un processus de réplication unidirectionnelle d'acide nucléique au cours duquel se produit une synthèse rapide de plusieurs copies des molécules d'ADN ou d'ARN du cycle.
Cependant, en utilisant la réaction PURExpress standard avec dNTP (nucléotide contenant C 5 H 10 O 4 désoxyribose ) et 4 nM pREP (milieu LB supplémenté en zéocine C 55 H 86 N 20 O 21 S 2 ), la synthèse d'ADN n'a pas été détectée en utilisant électrophorèse sur gel d'agarose * , ni par réaction en chaîne par polymérase en temps réel * ( 1b et 1c ).
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Pour améliorer la réplication de l'ADN sans l'implication de systèmes PURE spécialisés, il a été décidé d'optimiser le protocole de réaction PURExpress standard. Pour cela, le nombre relatif de facteurs de traduction, de ribosomes et d'un agent réducteur a été augmenté tout en abaissant les niveaux d'ARNt (ARN de transport) et de rNTP (ribonucléoside triphosphate) ( 1d ).

En utilisant cette composition PURE optimisée (PURErep), il a été possible d'obtenir une réplication de 5 à 12 fois des unités monomères pREP dans les réactions TTcDR ( 1b et 1e ). La synthèse de pREP pleine grandeur a été confirmée par digestion MluI * du produit de réplication ( 1c ).
MluI * est une endonucléase de restriction disponible dans le commerce, c'est-à-dire une enzyme qui catalyse l'hydrolyse des acides nucléiques.
L'expression de la protéine fluorescente verte (sfGFP) a été utilisée comme facteur d'évaluation de l'activité de traduction. Il a été constaté qu'un changement dans la composition de PURE a entraîné une diminution de 20 à 40% de la synthèse des protéines par rapport à PURE sans TTcDR. Cependant, cette diminution de l'expression des protéines reste acceptable étant donné la compatibilité améliorée du système PURErep avec la réplication de l'ADN.

L'analyse de la réplication de l'ADN basée sur qPCR a révélé un temps de doublement stable (1-2 heures) pour diverses concentrations initiales de la matrice, tandis que la réplication de l'ADN s'est poursuivie même après 24 heures à 30 ° C ( 1e ).

Le TTcDR était également stable pendant plus de cinq générations de dilution séquentielle lorsque seulement 4% du produit de réaction PURErep / pREP fini était directement transféré au nouveau mélange PURErep ( 1f) La principale conclusion de cette observation est que les produits TTcDR peuvent servir de modèles pour l'auto-réplication de l'ADN sur plusieurs générations.

Les scientifiques notent qu'une quantité importante de produit à faible mobilité électrophorétique est typique de la réplication sous forme d'anneau roulant, ce qui a été observé au cours des expériences. Ces produits de réaction peuvent être représentés par des concatémères de haut poids moléculaire * et / ou des clusters ADN / MgPPi.
Concatemer * - plusieurs copies de séquences d'ADN assemblées dans un cluster séquentiel.
La formation de produits d'une taille d'environ 5 kb a également été détectée. dans des échantillons non traités. Il s'ensuit que les réactions TTcDR peuvent produire des quantités importantes de copies monomères de pREP.

De plus, les scientifiques ont pu transformer les produits d' E. Coli après élimination du plasma parent. Les produits de réaction purifiés résultants étaient de taille identique aux pREP monomères.

À l'étape suivante, les scientifiques ont décidé de créer un ensemble de gènes codant pour les composants importants de la réaction PURE: 31, un facteur de traduction essentiel (FT) des bactéries E. coli .

Pour cela, TTcDR de pREP (4,6 kb) a été étudié conjointement avec chacun des trois grands plasmides *: pLD1 (30 pb, 13 FT), pLD2 (20 pb, 8 FT) et pLD3 (23 pb, 9 FT). Tous ont été clones pour fournir une expression recombinante de 30 des 31 facteurs de traduction de la bactérie E. coli .
Les plasmides * sont de petites molécules d'ADN capables de réplication indépendante.
Les produits TTcDR des quatre plasmides (y compris pREP) présentaient des caractéristiques de restriction MluI identiques: des plasmides clonaux, généralement propagés dans E. coli ( 2a ).


Image n ° 2

Il convient également de noter que les produits pLD TTcDR peuvent être directement transformés en E. coli , où ils sont stockés sous forme de plasmides monomères.

Le mélange PURErep modifié a également fourni une réplication complète des trois plasmides pLD avec PURErep pendant la réaction dans un milieu commun ( 2b ).

Les scientifiques ne se sont pas arrêtés là et déjà à l'étape suivante de l'étude, ils ont essayé d'étendre la charge génétique du système TTcDR en coproduisant des plasmides codant pour des composants supplémentaires du système PURE: EF-Tu (pEFTu), qui est absent dans le système pLD, ainsi que l' opéron de l' ARN ribosomal * rrnB ( L'ARNr est un ARNr précurseur) qui code pour l'ARNr 23S (ARN ribosomique), l'ARNr 16S, l'ARNr 6S et l'ARNt (ARN de transport, dans ce cas Glu2) ( 2c ).
L'opéron * est une unité fonctionnelle du génome unicellulaire, qui comprend des gènes codant pour des protéines.
Les expériences QPCR ciblant les amplicons spécifiques au plasmide * ont confirmé que les unités monomères des six plasmides (la longueur totale de l'ADN était de 93 kb) répliquées environ 2 à 8 fois par rapport au nombre d'origine ( 2c ).
Amplicon * est une unité d'amplification extrachromosomique ( copie de coupes d'ADN).
Une confirmation supplémentaire du succès de la réplication plasmidique conjointe a été la formation de colonies résistantes soit à la zéocine (pREP), soit à la kanamycine (plasmides pLD et prRNA), soit à la carbénicilline (pEFTu). Ces colonies étaient le résultat de la transformation des produits de réaction PURErep traités avec DpnI ( 2d ).

Les 26 colonies clonales sélectionnées, suivies d'une analyse de restriction, ont une nouvelle fois confirmé le succès du TTcDR des six plasmides ( 2e ).

En utilisant la même méthode que précédemment décrite, les scientifiques ont effectué une autre procédure pour la réplication conjointe de cinq plasmides supplémentaires: gènes pour le système de régénération minimale de nucléoside triphosphate basé sur la créatine kinase (pCKM), adénylate kinase (pAK1) et nucléoside diphosphate kinase (pNDK); ainsi que l'ARN polymérase T7 (T7RNAP) et la pyrophosphatase (pIPP).


Image n ° 3

D'une taille totale de 116,3 ko cet ensemble de 11 plasmides atteint> 100% de la longueur estimée du génome proposée pour un système minimal autorépliquant qui ne dépend que de nutriments de faible poids moléculaire ( 3a ).

Les scientifiques ont alors décidé de vérifier si PURErep peut fournir une expression génétique parallèle pendant la réplication. Pour cela, l'expression multicistronique de FT codée sur trois plasmides pLD: pLD1, pLD2 et plD3 (non compris pEFTu) a été examinée.

Afin d'étudier si PURErep est capable de supporter généralement l'expression multicistronique à partir de ces plasmides, une expression sans cellule a été réalisée à partir de chaque plasmide individuel en présence de BODIPY-Lys-tRNALys, qui fournit un marquage par fluorescence des produits de traduction.

Afin d'améliorer la sensibilité de détection et de permettre la quantification des protéines nouvellement synthétisées, une analyse quantitative de l'expression des protéines a en outre été réalisée sur la base de la spectrométrie de masse en utilisant des marqueurs isotopiques stables.


Image n ° 4

Cette analyse a fourni des preuves convaincantes de la synthèse de toutes les sous-unités FT des protéines codées par pLD ( 4a ). Une régénération partielle ou complète des protéines codées à la fois dans pLD2 et pLD3 a également été observée.

L'analyse de l'expression a montré que même dans PURErep non modifié en combinaison avec pREP, il existe une réplication complète de 32 cidrons FT codés par pLD et l'expression d'environ la moitié des chaînes peptidiques FT codées, dont le nombre correspond ou dépasse la chaîne initiale.

Pour une connaissance plus détaillée des nuances de l'étude, je vous recommande de consulter le rapport des scientifiques et les documents supplémentaires qui s'y rapportent.

Épilogue


Dans ce travail, les scientifiques ont réussi à réaliser ce que beaucoup de leurs collègues ne pouvaient que rêver auparavant: créer un système artificiel capable de se répliquer.

Exagéré, cela signifie qu'ils ont pu faire les premiers pas vers la création d'un système qui s'auto-reproduira, simulant ainsi autant que possible les processus biologiques.

Les auteurs de l'étude sont extrêmement satisfaits des résultats et prévoient d'étendre le génome artificiel avec des segments d'ADN supplémentaires à l'avenir. Ils veulent créer un système avec une coquille qui peut maintenir la viabilité en absorbant les nutriments et en éliminant les déchets. Une telle structure artificielle peut être utilisée comme un bio-appareil de production spécialisé pour des substances naturelles ou comme base pour créer des systèmes encore plus complexes.

Le clonage est un processus complexe, dont il ne fait aucun doute, mais la création d'un système synthétique complet et viable est d'un tout autre niveau. Quelqu'un dira que de telles études sont dangereuses, car personne n'a le droit d'assumer les responsabilités de mère nature. Cependant, la curiosité d'une personne est presque impossible à calmer. Notre désir de tout comprendre et de tout répéter est l'un des facteurs moteurs du progrès de la science. Pour le meilleur ou pour le pire, c'est une question pour laquelle il n'y a pas de réponse unique. Nous ne pouvons qu'admirer les réalisations d'esprits brillants et regarder prudemment vers l'avenir, tout en espérant une utopie.

Merci de votre attention, restez curieux et passez un bon week-end Ă  tous, les gars! :)

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