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Cuña por cuña: uso del virus PIV5 para crear una vacuna contra MERS-CoV y posiblemente contra SARS-CoV-2



Dadas las circunstancias actuales, no es de extrañar que la comunidad científica haya concentrado todas sus fuerzas en la búsqueda y el desarrollo de métodos y herramientas para combatir la propagación del virus. Hoy observamos un estudio en el que científicos de la Sociedad Estadounidense de Microbiología (ASM) describen una vacuna muy funcional contra el virus MERS, que comenzó a propagarse en 2012. Según los científicos, su desarrollo puede ayudar a crear una vacuna contra el actual SARS-CoV-2. ¿Cuál es la peculiaridad de la vacuna creada, a partir de la cual fue creada, y qué tan efectivamente realiza su tarea? Aprendemos sobre esto del informe de los científicos. Vamos.

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La pandemia COVID-19, una infección respiratoria aguda potencialmente grave causada por el coronavirus SARS-CoV-2 (2019-nCoV), se ha anunciado oficialmente en el mundo. Hay mucha información sobre Habré sobre este tema; recuerde siempre que puede ser confiable / útil, y viceversa.

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Base de estudio


MERS o el síndrome respiratorio del Medio Oriente es una enfermedad inflamatoria de los órganos respiratorios que se desarrolla debido a la infección con el virus del género Betacoronavirus de la ahora familiar subfamilia Coronavirinae.


Instantánea de MERS-CoV (amarillo).

La fuente del virus MERS-CoV es nuevamente murciélagos. Los primeros casos de infección entre personas se registraron en 2012 en el territorio de la Península Arábiga, pero en 2015 el virus había llegado a los países de Asia oriental y Europa. Según los últimos datos, el número de casos confirmados de infección por MERS-CoV es de 2494 personas, de las cuales 858 murieron (datos del 02.02.2020). Los datos varían de una fuente a otra, pero se ve claramente que el grado de distribución en MERS-CoV no es tan grande como en SARS-CoV-2. Sin embargo, el virus del Medio Oriente también tiene una tasa de mortalidad bastante alta: alrededor del 35%. Este indicador es el más preocupante.

MERS-CoV es un virus de ARN de cadena positiva * , en el que la penetración en las células objetivo se lleva a cabo debido a la proteína Ssobre viral * .
Virus de ARN de cadena positiva * - ARN viral positivo. Esto implica que una secuencia de ARN viral particular puede traducirse directamente en proteínas virales (por ejemplo, proteínas necesarias para la replicación del virus). Por lo tanto, en los virus de ARN con una cadena positiva, el gen de ARN viral puede considerarse un ARNm viral (ARN mensajero) y la célula huésped puede traducirlo inmediatamente.
Sobre viral * : un sobre adicional que cubre el sobre externo (cápside) de muchos virus.
La proteína S consiste en la subunidad S1 responsable de la unión al receptor del virus, la dipeptidil peptidasa 4 (DPP4 o CD26) a través del dominio de unión al receptor (RBD del dominio de unión al receptor ), así como la subunidad S2, que proporciona fusión de membrana.

Los investigadores recuerdan que en este momento no existe una vacuna contra MERS-CoV, solo hay una serie de desarrollos cuya efectividad es bastante dudosa. Los científicos creen que su trabajo cambiará esta situación.

En este estudio, los científicos decidieron centrar su atención en otro virus, el PIV5. Los virus PIV o parainfluenza (PG) tienen cinco variedades, tres de las cuales causan enfermedades en humanos (de PG-1 a PG-3) y dos que no son peligrosas para los humanos (PG-4 y PG-5).


Instantánea de TEM del virus de la parainfluenza.

PG-5 es miembro del género Rubulavirus de la familia Paramyxoviridae, que incluye el virus de las paperas (MuV o "paperas") y el virus de la parainfluenza humana tipo 2 (PG-2) y tipo 4 (PG-4). PG-5 codifica ocho proteínas virales conocidas. La proteína nucleocápside (NP), la fosfoproteína (P) y la proteína ARN polimerasa (L) son importantes para la transcripción * y la replicación * del genoma viral de ARN.
Transcripción * : el proceso de síntesis de ARN utilizando ADN como plantilla; transferencia de información genética del ADN al ARN.
La replicación * es el proceso de creación de dos moléculas de ADN hija basadas en el ADN parental.
Los científicos creen que PG-5 es un excelente candidato para vectores virales * para la futura vacuna. PG-5 es bastante seguro, a pesar de su alto grado de infecciosidad, que puede jugar en las manos al crear una vacuna efectiva.
Los vectores virales * son herramientas para entregar material genético a las células objetivo.
Además, PG-5 no tiene una fase de ADN en su ciclo de vida, lo que evita posibles modificaciones genéticas inadvertidas del ADN de la célula huésped por recombinación o inserción. Además, la estructura de PG-5 es bastante estable, en contraste con los virus de ARN con una cadena positiva. Esto es confirmado por el PG-5 recombinante creado que expresa el gen F para el virus sincitial respiratorio, cuando el gen F se mantuvo durante más de 10 generaciones.

Otra ventaja de PG-5 es su rentabilidad, ya que este virus puede crecer hasta 8x10 8 UFP / ml (UFP - unidades formadoras de placa).

Anteriormente, PG-5 ya se usaba como vector viral cuando se trabajaba con vacunas contra el virus sincitial respiratorio y la rabia. Durante los experimentos en ratones, se descubrió que el vector PG-5 que expresa la NA (neuraminidasa, que es parte de la membrana) del virus de la influenza conduce a la inmunización completa de los sujetos experimentales, es decir. 4 días después de la infección, no hubo un solo caso de muerte o incluso infección. Pero PG-5, que expresa NP (nucleoproteína), protege al 100% de los ratones experimentales de la cepa letal del virus de la gripe H1N1.

En base a resultados tan positivos de estudios previos, los científicos decidieron usar PG-5 como un vector viral que expresa la proteína S del virus MERS. Como antes, todos los experimentos se llevaron a cabo en ratones.

Resultados de la investigacion


Los investigadores introdujeron preliminarmente el gen HA (hemaglutinina) del virus de la influenza A en diferentes lugares del genoma PG-5 y descubrieron que los insertos en SH (pequeña hidrofóbica) y HN (hemaglutinina-neuraminidasa) dan una mejor respuesta inmune.
El virus de la gripe hemaglutinina y la neuraminidasa * son los antígenos de superficie del virus, que proporcionan la capacidad de unirse a las células objetivo.
Ante esto, se decidió introducir el gen S de tamaño completo del virus MERS en la intersección de SH y HN. Se construyó un plásmido * que contenía ADNc * PG-5 de longitud completa con un gen S insertado en la unión de SH y HN usando métodos estándar de clonación molecular ( 1A ).


Imagen No. 1
El plásmido * es una pequeña molécula de ADN que se separa de los cromosomas y es capaz de replicarse de forma independiente.
ADNc * : ADN complementario, es decir ADN sintetizado en una matriz de ARNm maduro (ARN mensajero) en una reacción catalizada por transcriptasa inversa.
El plásmido se transfectó * en células BHK * junto con plásmidos que expresan la ARN polimerasa TG, NP, P y L del virus PG-5 (PIV5).
Transfección * : la introducción de ácido nucleico en las células mediante un método no viral.
Las células BHK * ( riñón de hámster bebé ) son células de tejido conectivo (fibroblastos) de riñones de hámster que son sensibles a muchos virus que afectan a los humanos. Las células BHK se usan para la transformación, así como para transfecciones estables y transitorias.
El resultado fue el virus infeccioso PIV5-MERS-S, que se purificó aún más y se multiplicó en grandes cantidades en células MDBK * para su posterior análisis.
Células MDBK * ( células de riñón canino Madin-Darby ): células de riñón de perro, aisladas por primera vez en 1958 por los científicos SH Madin y NB Darby. Estas células se usan en la investigación como células modelo de mamífero.
El genoma del virus fue secuenciado y confirmó que contiene la secuencia de ADN de entrada deseada. A continuación, fue necesario verificar la expresión de la proteína S en las células infectadas con PIV5-MERS-S. Para esto, las células se infectaron a diferentes valores de MOI * , después de lo cual se lisaron (disolvieron) para inmunotransferencia * usando un anticuerpo anti-S.
MOI * ( multiplicidad de infección ): la multiplicidad de infección, es decir La proporción de agentes (virus) a objetivos de infección (células).
Immunoblotting * es un método altamente sensible para detectar proteínas, basado en una combinación de electroforesis e inmunoensayo enzimático o análisis radioinmune.
El análisis mostró la presencia de proteína S completa y fragmentos S2, lo que indica el éxito de su implementación ( 1B ). La expresión de la proteína S en células infectadas con PIV5-MERS-S se confirmó adicionalmente mediante análisis de inmunofluorescencia ( 1C ).

Los científicos señalan que PIV5-MERS-S causó la formación masiva de sincitio * en las células Vero * . Además, la cinética de crecimiento de PIV5-MERS-S y PG-5 convencional (PIV5) fue muy similar ( 1D ).
El sincitio * es un tipo de tejido en el que las células no están completamente separadas, es decir Hay secciones de citoplasma con núcleos que están interconectados por plasmodesmos (puentes citoplasmáticos).
Vero* — , .


Imagen No. 2

Inmunización PIV5-MERS-S genera anticuerpos neutralizantes e inmunidad mediada por células T. Para determinar si PIV5-MERS-S puede generar respuestas inmunes, se inmunizó a los ratones con una dosis única de PIV5-MERS-S o control del virus PIV5-GFP a 10 4 PFU o 10 6 PFU por individuo a través de la vía intranasal.

Si bien ambas dosis provocaron respuestas de anticuerpos, los títulos neutralizantes fueron modestos a 1:64 y 1: 128 para 10 4 y 10 6 dosis, respectivamente ( 2A y 2B ).

Los científicos recuerdan que los ratones de las especies C57BL / 6 y BALB / c después de la inmunización generan respuestas inmunes dominantes Th1 y Th2, respectivamente.
Th (T-helpers): linfocitos T que mejoran la respuesta inmune adaptativa (inmunidad adquirida).

Th1 : promueve el desarrollo de una respuesta inmune celular mediante la activación de los macrófagos.

Th2 : activa los linfocitos B, lo que ayuda al desarrollo de una respuesta inmune humoral.
Una dosis de PIV5-MERS-S (10 6 PFU) resultó en un título de anticuerpos neutralizantes de hasta 1: 2000 en ratones BALB / c ( 2C ), lo cual es consistente con la respuesta dominante de Th2 en ratones de esta especie.

Para evaluar la respuesta primaria de las células T CD8 * generadas por inmunización con PIV5-MERS-S, los ratones hDPP4-KI se inmunizaron intranasalmente con PIV5-MERS-S (10 4 PFU).
CD8* ( 8) — , - .
Cuatro semanas después, se tomó una cerca para examinar la presencia / ausencia de células T CD8 residentes pulmonares específicas de MERS-CoV ( 3A ).


Imagen No. 3

Como se muestra en 3B - 3D , hubo un aumento significativo en el porcentaje y el número total de células CD8-IFN en los pulmones de ratones inmunizados con PIV5-MERS en comparación con los infectados con PIV5-GFP.

Para evaluar la respuesta de las células T CD8 específicas de MERS-S, se realizó una inyección adicional de MERS-CoV MA (10 4 UFP). Como resultado, se observó un aumento significativo en la respuesta de las células T CD8 al cuarto día en comparación con los ratones infectados con el control PIV5-GFP ( 3E - 3G)

También se observó un aumento de 10 veces en las células T CD8 específicas de MERS-S en comparación con la respuesta primaria de las células T CD8 ( 3B - 3G ).


Imagen No. 4

Como resultado de la inmunización PIV5-MERS-S previene la muerte de infección en ratones. Para determinar la efectividad de PIV5-MERS-S en la prevención o modificación del virus MERS-CoV, los ratones hDPP4 KI se inmunizaron con PIV5-MERS-S (10 4 PFU) por vía intranasal.

4 semanas después de la inmunización, los ratones se infectaron con MERS-S modificado para ser más activo en ratones ( 4A ). Todos los ratones inmunizados con PIV5-MERS-S sobrevivieron a esta infección mortal, con una ligera pérdida de peso ( 4B y4C ). En contraste, todos los ratones infectados con el control PIV5-GFP o PBS murieron después de la infección. Esto indica que PIV5-MERS-S protegió completamente a los ratones de la infección letal.

A pesar de que los ratones inmunizados con PIV5-MERS-S tenían una mayor tasa de eliminación pulmonar del virus, este método no proporcionó inmunidad esterilizante completa ( 4D ).


Imagen No. 5

Los estudios histopatológicos de los pulmones después de la infección mostraron que los ratones inmunizados con PIV5-MERS-S tenían significativamente menos restos celulares * y más infiltrados mononucleares ( 5A y 5B ).
Los restos celulares * son el resto de la célula rodeada por una membrana plasmática que es fagocitada por los macrófagos.
También se detectó una fuerte infiltración de leucocitos (principalmente células mononucleares) y menos daño (edema, membranas hialinas, restos de células necróticas, etc.).

En la etapa final del estudio, los científicos evaluaron las respuestas protectoras inducidas por PIV5-MERS-S o MERS-CoV inactivado. Para esto, algunos ratones fueron inmunizados con PIV5-MERS-S (10 4 PFU) o PBS, mientras que otros fueron inmunizados con MERS-CoV inactivado por UV.

Mientras que PIV5-MERS-S proporcionó una protección del 100% contra la infección letal, el MERS-CoV inactivado protegió solo al 25% de los ratones (imagen a continuación).


Imagen No. 6

A continuación, se realizó un estudio de los pulmones de ratones que primero fueron inmunizados y luego infectados con MERS-CoV (imagen a continuación).


Imagen No. 7

Se observaron más eosinófilos (un tipo de glóbulo blanco) en los pulmones en ratones inmunizados con MERS-CoV inactivado que en ratones inmunizados con PBS o PIV5-MERS-S después de la infección con MERSCoV.

En comparación con PBS, la infiltración eosinofílica perivascular aumentó significativamente en el grupo MERS-CoV inactivado, pero no se observó diferencia estadística en comparación con el grupo inmunizado con PIV5-MERS-S.

También se realizó una evaluación de la formación de una membrana hialina en los alvéolos de los pulmones, que es un claro signo de enfermedad pulmonar grave. En comparación con el grupo PBS, los ratones inmunizados con PIV5-MERS-S mostraron una protección significativa contra la formación de membrana hialina. Pero los ratones inmunizados con MERS-CoV inactivado mostraron solo una ligera disminución en la formación de la membrana hialina, lo que indica la baja eficacia de este método de inmunización en comparación con PIV5-MERS-S.

Para un conocimiento más detallado de los matices del estudio, le recomiendo que consulte el informe de los científicos .

Epílogo


En este trabajo, los científicos pudieron demostrar un método bastante exitoso para inmunizar ratones con el virus MERS-CoV, que ha estado caminando libremente en nuestro planeta desde 2012.

La principal característica distintiva del método desarrollado es el uso de otro virus, a saber, PG-5, como vector viral. En otras palabras, la cuña es golpeada por la cuña.

El uso del virus como transporte para la entrega de genes necesarios para la inmunización puede considerarse un método bastante inusual, pero puede contribuir a una lucha más efectiva contra los virus. Los propios investigadores dicen que su trabajo está dirigido no solo a combatir MERS-CoV, sino también con SARS-CoV-2 (COVID-19). Ambos virus pertenecen a la misma subfamilia, tienen vías de infección y efectos similares en las células objetivo. Si el método desarrollado de inmunización se desarrolla aún más, entonces puede ser posible crear una vacuna suficientemente efectiva.

Esto es lo que los autores de este trabajo planean hacer en el futuro. Ya sea que tengan éxito en crear una súper vacuna o no, el tiempo lo dirá. Sin embargo, ahora son dignos de todos los elogios, al menos por prestar atención al virus, del que todos parecían olvidarse.

Sea como fuere, solo podemos esperar que la ciencia y todos los involucrados, como muchas veces antes, puedan superar todos los prejuicios y miedos, superar todos los obstáculos y mostrar que el pensamiento analítico, basado en el conocimiento y la lógica, siempre es capaz de encuentre una salida a cualquier situación actual, no importa cuán terrible sea a primera vista.

Gracias por su atención, sigan curiosos y tengan una buena semana laboral, muchachos.

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