Get best of the week

"Mira, esto es algo": autorreplicación del ADN artificial



Una de las principales características distintivas de cualquier organismo vivo es la capacidad de guardar y reproducir la información necesaria para crear su propia especie. Esto se manifiesta principalmente en la replicación del ADN, cuando un par de hijas aparecen del mismo ADN original, que son una copia exacta de su progenitor. En la naturaleza, este proceso se observa en todas partes, pero es extremadamente difícil recrearlo en condiciones de laboratorio desde cero, sin embargo, es bastante realista.

Científicos del Instituto de Bioquímica. Max Planck (Alemania) creó con éxito un sistema biológico que tiene la capacidad de replicar su propio ADN. ¿Qué técnicas se usaron para crear ADN de replicación sintética, qué tan efectivo es el sistema resultante y qué significa este descubrimiento para la biología sintética moderna? Encontraremos respuestas a estas preguntas en el informe de los científicos. Vamos.

Base de estudio


En el campo de la creación de sistemas biológicos artificiales, la capacidad de replicarse es un aspecto clave de la utilidad del sistema creado. Según los científicos, esto se puede lograr mediante la implementación de los componentes básicos: replicación * , transcripción * y traducción de ADN * .
* — .
* — , .. .
* — , .
En otras palabras, para crear una vida artificial completa, es necesario implementar una reproducción autocodificada, es decir, autorreplicación. Este es un proceso extremadamente complicado y confuso.

Los autores del estudio señalan que en los sistemas basados ​​en la bioquímica existente, por ejemplo, MPC ( células basadas en proteínas mínimas) , la autorreplicación requiere un replanteamiento completo de la biología molecular, incluida la replicación, transcripción y traducción del ADN, teniendo en cuenta un entorno completamente libre de células.

La síntesis de proteínas a partir de ADN se puede lograr en ciertos sistemas recombinantes basados ​​en fago * ARN polimerasas, las partes principales del mecanismo de traducción de Escherichia coli y el sistema de regeneración de energía mínima, es decir. PURE - Síntesis de proteínas utilizando elementos recombinantes (síntesis de proteínas utilizando elementos recombinantes).
Los bacteriófagos o fagos * son virus que infectan selectivamente las células bacterianas y arqueológicas. En biología, se usa como un vector (ADN para transferir material genético a la célula).
Mientras tanto, sigue siendo extremadamente difícil recrear el proceso de replicación de ADN del genoma basado en la transcripción y traducción (TTcDR - transcripción - replicación de ADN acoplada a traducción ), que codifica todos los componentes macromoleculares del sistema PURE utilizando replicoma autocodificado * .
Replisoma * es un complejo de múltiples proteínas que replica el ADN bacteriano.
La replicación de ADN basada en ADN polimerasas (DNAP) de fagos (por ejemplo, Phi29) puede ayudar a implementar la técnica TTcDR.

Sin embargo, en el método TTcDR, el genoma Phi29 de tamaño completo solo se puede lograr bloqueando algunos de los factores de replicación.

Todos los métodos anteriores tienen sus ventajas teóricas, pero en la práctica no dieron un resultado completo. En el trabajo que estamos considerando hoy, los científicos describen un sistema de traducción que proporciona replicación y expresión autocodificada de genomas de ADN grandes en condiciones libres de células bien definidas. En particular, se logró la autorreplicación del genoma de más de 116 kb. (miles de pares de nucleótidos), que cubren la gama completa de factores de traducción Escherichia coli(Escherichia coli), los tres ARN ribosómicos, el sistema de regeneración de energía, así como las ARN y las ADN polimerasas * .
La polimerasa * es una enzima que realiza la síntesis de polímeros de ácidos nucleicos. La ADN polimerasa sintetiza ADN, y la ARN polimerasa sintetiza ARN. Este proceso continúa a través de la copia complementaria de ADN o ARN parentales.
Además, el sistema creado demostró la capacidad de sintetizar más de 30 factores de traducción, la mitad de los cuales se expresa en cantidades iguales o mayores que las introductorias.

Resultados de la investigacion


En la primera etapa, los científicos probaron el TTcDR autocodificado dependiente de Phi29-DNAP utilizando el protocolo estándar del sistema PURExpress .

La región de codificación Phi29-DNAP flanqueada por el promotor * T7 se clonó primero en el vector pCR-Blunt TOPO (pREP, 1a ).
Promotor * es una secuencia de nucleótidos de ADN utilizada por la ARN polimerasa como una región para el inicio de la transcripción.


Imagen n. ° 1

En teoría, esta arquitectura debería proporcionar replicación espontánea de ARN como un anillo rodante * utilizando DNAP auto codificado sin proteínas de replicación adicionales o cebadores de ADN provistos externamente.
Rolling Ring Type Replication * es un proceso de replicación de ácido nucleico unidireccional durante el cual se produce una síntesis rápida de múltiples copias de las moléculas de ADN o ARN del anillo.
Sin embargo, al usar la reacción PURExpress estándar con dNTP (nucleótido que contiene desoxirribosa C 5 H 10 O 4 ) y pREP 4 nM (medio LB suplementado con zeocina C 55 H 86 N 20 O 21 S 2 ), la síntesis de ADN no se detectó usando electroforesis en gel de agarosa * , ni por reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real * ( 1b y 1c ).
* — , .
* — .
Para mejorar la replicación del ADN sin la participación de sistemas PURE especializados, se decidió optimizar el protocolo de reacción PURExpress estándar. Para esto, se aumentó el número relativo de factores de traducción, ribosomas y un agente reductor al tiempo que se redujeron los niveles de tRNA (ARN de transporte) y rNTP (ribonucleósido trifosfato) ( 1d ).

Usando esta composición PURE optimizada (PURErep), fue posible lograr una replicación de 125–12 veces de las unidades monoméricas pREP en las reacciones TTcDR ( 1b y 1e ). La síntesis de pREP de tamaño completo se confirmó por digestión con MluI * del producto de replicación ( 1c ).
MluI * es una endonucleasa de restricción disponible comercialmente, es decir Una enzima que cataliza la hidrólisis de los ácidos nucleicos.
La expresión de la proteína verde fluorescente (sfGFP) se utilizó como factor de evaluación de la actividad de traducción. Se encontró que un cambio en la composición de PURE condujo a una disminución en la síntesis de proteínas en un 20-40% en comparación con PURE sin TTcDR. Sin embargo, esta disminución en la expresión de proteínas sigue siendo aceptable dada la compatibilidad mejorada del sistema PURErep con la replicación del ADN.

El análisis de la replicación de ADN basado en qPCR reveló un tiempo de duplicación estable (1-2 horas) para varias concentraciones de matriz iniciales, mientras que la replicación de ADN continuó incluso después de 24 horas a 30 ° C ( 1e ).

TTcDR también fue estable durante más de cinco generaciones de dilución secuencial cuando solo el 4% del producto de reacción PURErep / pREP terminado se transfirió directamente a la nueva mezcla PURErep ( 1f) La principal conclusión de esta observación es que los productos TTcDR pueden servir como plantillas para la autorreplicación del ADN durante varias generaciones.

Los científicos señalan que una cantidad significativa de producto con baja movilidad electroforética es típica para la replicación como un anillo rodante, que se observó durante los experimentos. Estos productos de reacción pueden estar representados por concatemers * de alto peso molecular y / o grupos de DNA / MgPPi.
Concatemer * : múltiples copias de secuencias de ADN ensambladas en un grupo secuencial.
También se detectó la formación de productos con un tamaño de ~ 5 kb. en muestras no tratadas Se deduce que las reacciones TTcDR pueden producir cantidades significativas de copias monoméricas de pREP.

Además, los científicos pudieron transformar los productos de E. coli después de la extracción del plasma original. Los productos de reacción purificados resultantes tenían un tamaño idéntico a los pREP monoméricos.

En la siguiente etapa, los científicos decidieron crear un conjunto de genes que codifican los componentes importantes de la reacción PURE: 31, un factor de traducción esencial (FT) de la bacteria E. coli .

Para esto, se estudió TTcDR de pREP (4.6 kb) junto con cada uno de los tres plásmidos grandes *: pLD1 (30 pb, 13 FT), pLD2 (20 pb, 8 FT) y pLD3 (23 pb, 9 FT). Todos fueron clonados para proporcionar la expresión recombinante de 30 de los 31 factores de traducción de la bacteria E. coli .
Los plásmidos * son pequeñas moléculas de ADN capaces de replicación independiente.
Los productos TTcDR de los cuatro plásmidos (incluido pREP) mostraron características de restricción MluI idénticas: plásmidos clonales, típicamente propagados en E. coli ( 2a ).


Imagen No. 2

También vale la pena señalar que los productos pLD TTcDR pueden transformarse directamente en E. coli , donde se almacenan como plásmidos monoméricos.

La mezcla PURErep modificada también proporcionó la replicación completa de los tres plásmidos pLD junto con PURErep durante la reacción en un medio común ( 2b ).

Los científicos no se detuvieron allí y ya en la siguiente etapa del estudio intentaron expandir la carga genética del sistema TTcDR co-replicando plásmidos que codifican componentes adicionales del sistema PURE: EF-Tu (pEFTu), que está ausente en el sistema pLD, así como el operón de ARN ribosómico * rrnB ( prRNA es un precursor rRNA) que codifica 23S rRNA (ribosomal RNA), 16S rRNA, 6S rRNA y tRNA (transporte de ARN, en este caso Glu2) ( 2c ).
Operon * es una unidad funcional del genoma unicelular, que incluye genes que codifican proteínas.
Los experimentos de QPCR dirigidos a amplicones específicos de plásmido * confirmaron que las unidades monoméricas de los seis plásmidos (la longitud total del ADN fue de 93 kb) se replicaron aproximadamente de 2 a 8 veces en comparación con el número original ( 2c ).
Amplicon * es una unidad de amplificación extracromosómica (copias de secciones de ADN).
La confirmación adicional del éxito de la replicación conjunta de plásmidos fue la formación de colonias resistentes a zeocina (pREP), a kanamicina (plásmido pLD y prRNA), o a carbenicilina (pEFTu). Estas colonias fueron el resultado de la transformación de los productos de reacción PURErep tratados con DpnI ( 2d ).

Las 26 colonias clonales seleccionadas seguidas por análisis de restricción confirmaron una vez más el éxito del TTcDR de los seis plásmidos ( 2e ).

Utilizando el mismo método descrito anteriormente, los científicos llevaron a cabo otro procedimiento para la replicación conjunta de cinco plásmidos adicionales: genes para el sistema mínimo de regeneración de nucleósido trifosfato basado en creatina quinasa (pCKM), adenilato quinasa (pAK1) y nucleósido difosfato quinasa (pNDK); así como la ARN polimerasa T7 (T7RNAP) y la pirofosfatasa (pIPP).


Imagen No. 3

Con un tamaño total de 116.3 kb Este conjunto de 11 plásmidos alcanza> 100% de la longitud estimada del genoma propuesta para un sistema mínimo de autorreplicación que depende solo de nutrientes de bajo peso molecular ( 3a ).

Luego, los científicos decidieron verificar si PURErep puede proporcionar una expresión génica paralela durante la replicación. Para esto, se examinó la expresión multicistrónica de FT codificada en tres plásmidos pLD: pLD1, pLD2 y plD3 (sin incluir pEFTu).

Para investigar si PURErep es capaz de soportar generalmente la expresión multicistrónica de estos plásmidos, se realizó la expresión libre de células de cada plásmido individual en presencia de BODIPY-Lys-tRNALys, que proporciona el marcado de fluorescencia de los productos de traducción.

Con el fin de mejorar la sensibilidad de detección y permitir la cuantificación de las proteínas recién sintetizadas, se realizó un análisis cuantitativo de la expresión de proteínas basado en la espectrometría de masas utilizando etiquetas isotópicas estables.


Imagen No. 4

Este análisis proporcionó evidencia convincente para la síntesis de todas las subunidades FT de proteínas codificadas por pLD ( 4a ). También se observó la regeneración parcial o completa de proteínas codificadas en pLD2 y pLD3.

El análisis de la expresión mostró que incluso en PURErep no modificado en combinación con pREP, hay una replicación completa de 32 cidrones FT codificados por pLD, y la expresión de aproximadamente la mitad de las cadenas de péptidos FT codificadas, cuyo número corresponde o excede la inicial.

Para un conocimiento más detallado de los matices del estudio, le recomiendo que consulte el informe de los científicos y materiales adicionales .

Epílogo


En este trabajo, los científicos lograron lograr lo que muchos de sus colegas antes solo podían soñar: crear un sistema artificial que sea capaz de autorreplicarse.

Exagerar diciendo que esto significa que pudieron dar los primeros pasos hacia la creación de un sistema que se auto-reprodujera, simulando procesos biológicos lo más posible.

Los autores del estudio están extremadamente satisfechos con los resultados y planean expandir el genoma artificial con segmentos adicionales de ADN en el futuro. Quieren crear un sistema con una cubierta que pueda mantener la viabilidad mediante la absorción de nutrientes y la eliminación de desechos. Dicha estructura artificial puede usarse como un biodispositivo de producción especializado para sustancias naturales o como base para crear sistemas aún más complejos.

La clonación es un proceso complejo, del cual no hay duda, pero la creación de un sistema sintético completo y viable es un nivel completamente diferente. Alguien dirá que tales estudios son peligrosos, porque nadie tiene derecho a asumir las responsabilidades de la madre naturaleza. Sin embargo, la curiosidad de una persona es casi imposible de calmar. Nuestro deseo de entender todo y repetir todo es uno de los factores impulsores en el progreso de la ciencia. Para bien o para mal, esta es una pregunta para la que no hay una respuesta única. Solo podemos admirar los logros de las mentes brillantes y mirar con cautela hacia el futuro, mientras esperamos una utopía.

¡Gracias por su atención, tengan curiosidad y tengan un gran fin de semana a todos, muchachos! :)

Un poco de publicidad :)


Gracias por estar con nosotros. ¿Te gustan nuestros artículos? ¿Quieres ver más materiales interesantes? Apóyenos haciendo un pedido o recomendando a sus amigos, VPS en la nube para desarrolladores desde $ 4.99 , un análogo único de servidores de nivel básico que inventamos para usted: toda la verdad sobre VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 núcleos) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps desde $ 19 o cómo dividir el servidor? (las opciones están disponibles con RAID1 y RAID10, hasta 24 núcleos y hasta 40GB DDR4).

Dell R730xd 2 veces más barato en el centro de datos Equinix Tier IV en Amsterdam? ¡Solo tenemos 2 x Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 TV desde $ 199 en los Países Bajos!Dell R420 - 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB - ¡desde $ 99! Lea sobre Cómo construir un edificio de infraestructura. clase c con servidores Dell R730xd E5-2650 v4 que cuestan 9,000 euros por un centavo?

More articles:


All Articles