👨🏾‍🚀 😃 🥦 Sars wunderbar? Genealogie von Wuhan Coronavirus 📋 🥋 ⚓️

Nein, was ist von Menschen gemacht? Was für ein Unsinn? Ich dachte, als ich zum ersten Mal die Hypothese hörte, dass Kovid-19 entweder durch Laborleckage oder sogar durch einen gezielten Bioangriff verursacht wurde. Und jedes Mal wies er diese Spekulationen einfach zurück, wenn sie in einem stürmischen Strom von Coronavirus-Infoshum wieder auf mich zukamen. Denken Sie daran, es gibt ein Institut für Virologie in Wuhan, man weiß es nie.

Irgendwann war es bereits notwendig, es vernünftig abzulehnen, weil die Befürworter der Männlichkeit begannen, ihre Thesen über die mögliche künstliche Natur des Virus mit Argumenten aus der Molekularbiologie zu untermauern , und hier wollte ich ihre Verschwörungstheorien bereits mit kalten wissenschaftlichen Fakten zerschlagen. Nun, wenn nicht als Autoren eines Artikels in Nature (es schien mir), dann zumindest als Panchin, der von mir respektiert wird .

Und hier, in Verfolgung der Argumente gegen das vom Menschen verursachte Virus, hat mich das Virus des Zweifels infiziert. Was ist eigentlich der Grund für Zweifel? Je tiefer Sie in den letzten 15 bis 20 Jahren in die Aktivitäten von Coronavirusologen eintauchen, desto besser verstehen Sie, dass die Schaffung genau solcher Chimären wie CoV2 in ihnen an der Tagesordnung war. Und CoV2 ist eine offensichtliche Chimäre, die auf dem Fledermausstamm von RaTG13 basiert, bei der die Rezeptorbindungsstelle (RBM) im Spike-Protein durch Pangolinium aus der Fledermaus ersetzt wird, und zusätzlich wird ein spezieller Abschnitt von 4 Aminosäuren eingefügt, der eine Furin-Spaltstelle erzeugt, die wie Virologen haben zuvor festgestellt, dass das "Repertoire" des Virus hinsichtlich seiner Zellen, in die es eindringen kann, erheblich erweitert wird.Höchstwahrscheinlich gelang es der neuen Mutante dank dieser neuen Furin-Stelle, von den ursprünglichen Trägern zu den Menschen zu springen.

Angesichts der Höhen, die die Gentechnik heute erreicht hat, wäre die Synthese von CoV2 mit der oben beschriebenen Methode selbst für einen unerfahrenen Spezialisten nicht schwierig. In der Tat waren Virologen, darunter Shi Zhengli , der Leiter der Coronavirus- Abteilung am Wuhan-Institut für Virologie , wiederholt an solchen Dingen beteiligt - wie dem Ersetzen von RBM bei einem Virustyp durch RBM von einem anderen(hier ist die Arbeit der Shi Zhengli-Gruppe aus dem Jahr 2007) und durch Hinzufügen einer neuen Furinstelle, die dem für eine Tierart spezifischen Coronavirus die Möglichkeit geben kann, den ACE2-Rezeptor anderer Arten zu verwenden.

UFO Care Minute

Die Pandemie COVID-19, eine potenziell schwere akute Atemwegsinfektion, die durch das SARS-CoV-2-Coronavirus (2019-nCoV) verursacht wird, wurde weltweit offiziell angekündigt. Zu diesem Thema gibt es viele Informationen zu Habré - denken Sie immer daran, dass es sowohl zuverlässig / nützlich sein kann als auch umgekehrt.

Wir bitten Sie dringend, veröffentlichte Informationen zu kritisieren.

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Shi Zhengli in seinem Labor am Wuhan Institute of Virology

Aber bevor Verschwörung hier Zucht, lassen Sie uns tauchen Sie ein in die Bio - logie.

Biologie

Beginnen wir also mit dem Herd. Welche Art von Furinstelle, welche Art von RBM, welche Art von Spike-Protein im Allgemeinen? Wenn Sie durch den Dschungel der Terminologie waten, ist alles konzeptionell einfach. Zum Beispiel ist ein stacheliges Protein genau das, was aus einem Viruspartikel (S-Protein) herausragt, für das diese Viren „gekrönt“ sind:

Mit Hilfe dieser Proteine klammert sich das Virion an den Rezeptor der Opferzelle (in unserem Fall ACE2) und dringt dann in das Innere ein. Daher können wir sagen, dass dies der wichtigste Teil des Virus ist, da es bestimmt, welche Tiere betroffen sein können und welche nicht - ACE2-Rezeptoren in verschiedenen Spezies unterscheiden sich geringfügig strukturell. Gleichzeitig beträgt das Gen dieses Proteins aus dem gesamten 30-Kilobasen-Genom nach viralen Maßstäben nur 12–13%, dh etwa 1300 Aminosäuren. So ist das Spike-Protein in CoV2 und seinen nahen Verwandten strukturiert:

Wie aus der obigen Abbildung ersichtlich ist, besteht das S-Protein aus zwei Untereinheiten: S1 und S2. Es ist S1, das mit dem ACE2-Rezeptor interagiert, und der Ort, an dem er sich befindet, wird als Rezeptorbindungsdomäne (RBD) bezeichnet, und der Bereich des direkten Kontakts, das Allerheiligste, wird als Rezeptorbindungsmotiv (RBM) bezeichnet. Hier ist eine schöne Illustration aus einer ebenso schönen Arbeit :

RBD CoV2, ACE2.
() 2019-nCov. NTD, N- . RBD, - . RBM, - . SD1, 1. SD2, 2. FP, . HR1, 1. HR2, 2. TM, . IC, .
() RBD 2019-nCov. RBM .
() RBD 2019-nCov, ACE2. ACE2 . RBD 2019-nCoV , RBM — . RBD 2019-nCov . N- ACE2, , .
Overall structure of 2019-nCoV RBD bound with ACE2.
(a) Overall topology of 2019-nCoV spike monomer. NTD, N-terminal domain. RBD, receptor-binding domain. RBM, receptor-binding motif. SD1, subdomain 1. SD2, subdomain 2. FP, fusion peptide. HR1, heptad repeat 1. HR2, heptad repeat 2. TM, transmembrane region. IC, intracellular domain.
(b) Sequence and secondary structures of 2019-nCoV RBD. The RBM is colored red.
() Overall structure of 2019-nCoV RBD bound with ACE2. ACE2 is colored green. 2019-nCoV RBD core is colored cyan and RBM is colored red. Disulfide bonds in the 2019-nCoV RBD are shown as stick and indicated by yellow arrows. The N-terminal helix of ACE2 responsible for binding is labeled.

Also. Wenn das CoV2-Genom nur entschlüsselt wurde, waren zunächst keine direkt damit verbundenen Stämme bekannt. Doch bereits am 23. Januar 2020 veröffentlichte Shi Zhengli eine Arbeit, in der sie bekannt gab, dass CoV2 zu 96% mit dem RaTG13-Stamm übereinstimmt, den ihr Labor 2013 aus Yunnan-Fledermäusen isoliert hatte. Zwar wusste bis Januar 2020 außerhalb ihres Labors niemand von dieser Sorte.

Es war sofort klar, dass RaTG13 ein besonderer Junge ist. Schauen Sie sich die Tabelle an:

Dies ist ein Diagramm der Ähnlichkeit von CoV2 mit anderen bekannten Stämmen. Je höher die Kurve ist, desto höher ist der Prozentsatz der Nukleotidanpassung. Wie Sie sehen können, befindet sich im Bereich des Gens des sehr stacheligen Proteins (S) nur RaTG13 mehr oder weniger nahe an CoV2, und alle anderen Stämme an diesem Ort erreichen den Höhepunkt - sowohl Virusstämme von anderen Fledermäusen als auch das erste SARS-CoV (rote Kurve) ) Aber bis jetzt gibt es nichts Verdächtiges - gibt es unbekannte Stämme von Yunnan-Höhlen, die noch unbekannte Arten von Wissenschaft beherbergen? Ja, es ist nicht ganz klar, wie genau der Virus von dort nach Wuhan gelangt ist, aber was passiert nicht?

Pangoline

Dann tauchten Pangoline auf: Im Februar entdeckte eine andere Gruppe chinesischer Wissenschaftler in ihren Behältern einen Pangolin-Coronavirus-Stamm, der, obwohl im Allgemeinen schlechter als RaTG13, CoV2 (90%) ähnlich war, da das RBM-Spike-Protein fast identisch war - es war anders nur für 1 Aminosäure (siehe die beiden oberen Sequenzen, Punkte bedeuten Übereinstimmung mit der ersten Sequenz):

Darüber hinaus ist im ersten Viertel des S-Proteins der Pangolinium-Stamm CoV2 nicht ähnlich, und die Sequenz nach RBM in allen drei Stämmen (CoV2, Pangolin, RaTG13) stimmt mehr oder weniger überein. Das RBM von RaTG13 selbst unterscheidet sich jedoch stark von CoV2, was sich aus dem steilen Abfall des grünen RaTG13-Diagramms im Vergleich zum roten CoV2-Diagramm im RBM-Bereich (rosa vertikaler Balken) im folgenden Diagramm ergibt:

Dieser Unterschied wird auch durch die phylogenetische Analyse dieser drei in der obigen Grafik hervorgehobenen Bereiche bestätigt. Laut RBM liegt der Pangolin-Stamm näher an CoV2 als an RaTG13, links und rechts von RBM an CoV2 jedoch näher an RaVG13. Das heißt, es gibt eine offensichtliche Rekombination, wie die Autoren selbst und einige andere Werke erwähnen.

Woher kamen die Pangoline übrigens von den Forschern? Und von hier aus:

Sie wurden vom chinesischen Zoll von Schmugglern beschlagnahmt und in ein Rehabilitationszentrum in Guangdong gebracht, wo sie an schweren Coronavirus-Symptomen starben. Dies konnte natürlich nur lokale Virologen interessieren, die verschiedene Biomaterialien aus ihnen isolierten:

, , - 2019 . (Manis pentadactyla) 25 (Manis javanica). ; , , . , , , , , , .
Pangolins used in the study were confiscated by Customs and Department of Forestry of Guangdong Province in March-December 2019. They include four Chinese pangolins (Manis pentadactyla) and 25 Malayan pangolins (Manis javanica). These animals were sent to the wildlife rescue center, and were mostly inactive and sobbing, and eventually died in custody despite exhausting rescue efforts. Tissue samples were taken from the lung, lymph nodes, liver, spleen, muscle, kidney, and other tissues from pangolins that had just died for histopathological and virological examinations.

Übrigens und nicht nur lokal, denn auch andere chinesische Forscher (in diesem Fall Hongkong) erhielten Proben beschlagnahmter Pangoline und veröffentlichten im Februar 2020 eine ähnliche Arbeit , in der deutliche Anzeichen einer Rekombination im CoV2-Spike-Protein festgestellt wurden:

Wir erhielten Proben von gefrorenem Gewebe (Lunge, Darm, Blut), die von August 2017 bis Januar 2018 von 18 malaiischen Schuppenflechten ( Manis javanica ) entnommen wurden . Diese Pangoline wurden während der Anti-Schmuggel-Operationen von Guangxi Customs erhalten. Es ist erstaunlich, dass eine Hochleistungssequenzierung ihrer RNA das Vorhandensein von Coronaviren in sechs (zwei Lungen, zwei Därme, eine Mischung aus Lungen und Därmen, ein Blut) von 43 Proben ergab.
...
, , , RaTG13 2019-CoV2 (. 1c, d). , 2019-CoV2 - (RBD; 97,4%; . 1c . 2a), 2019-CoV2 RaTG13. RaTG13 2019-CoV2 89,2% RBD. 2019-CoV2 RBD, RaTG13 2019-CoV2 ( 442, SARS-CoV ).
We received frozen tissue (lungs, intestine, blood) samples that were collected from 18 Malayan pangolins (Manis javanica) during August 2017-January 2018. These pangolins were obtained during the anti-smuggling operations by Guangxi Customs. Strikingly, high-throughput sequencing of their RNA revealed the presence of coronaviruses in six (two lung, two intestine, one lung-intestine mix, one blood) of 43 samples. With the sequence read data, and by filling gaps with amplicon sequencing, we were able to obtain six full or nearly full genome sequences — denoted GX/P1E, GX/P2V, GX/P3B, GX/P4L, GX/P5E and GX/P5L — that fall into the 2019-CoV2 lineage (within the genus Betacoronavirus) in a phylogenetic analysis (Figure 1a).
…
More notable, however, was the observation of putative recombination signals between the pangolins coronaviruses, bat coronaviruses RaTG13, and human 2019-CoV2 (Figure 1c, d). In particular, 2019-CoV2 exhibits very high sequence similarity to the Guangdong pangolin coronaviruses in the receptor-binding domain (RBD; 97.4% amino acid similarity; indicated by red arrow in Figure 1c and Figure 2a), even though it is most closely related to bat coronavirus RaTG13 in the remainder of the viral genome. Bat CoV RaTG and the human 2019-CoV2 have only 89.2% amino acid similarity in RBD. Indeed, the Guangdong pangolin coronaviruses and 2019-CoV2 possess identical amino acids at the five critical residues of the RBD, whereas RaTG13 only shares one amino acid with 2019-CoV2 (residue 442, human SARS-CoV numbering).

Übrigens haben die Autoren dieses Artikels auch die explizite phylogenetische Mosaizität des CoV2-Spike-Proteins hervorgehoben:

Interessanterweise zeigte die phylogenetische Analyse nur synonymer Stellen bei RBD, dass die phylogenetische Position des Guangdong-Pangolins mit der des übrigen viralen Genoms übereinstimmt, nämlich dass es nicht der engste Verwandte von 2019-CoV2 ist (Abbildung 2b). Daher ist es möglich, dass die Ähnlichkeit von Aminosäuren in der RBD von Pangolin-Coronaviren und 2019-CoV2 eher auf einer selektiv vermittelten konvergenten Evolution als auf einer Rekombination beruht, obwohl es schwierig ist, auf der Grundlage der verfügbaren Daten zwischen diesen Szenarien zu wählen.
Quellentext
Interestingly, a phylogenetic analysis of synonymous sites alone in the RBD revealed that the phylogenetic position of the Guangdong pangolin is consistent with that in the remainder of the viral genome, rather than being the closest relative of 2019-CoV2 (Figure 2b). Hence, it is possible that the amino acid similarity between the RBD of the Guangdong pangolin coronaviruses and 2019-CoV2 is due to selectively-mediated convergent evolution rather than recombination, although it is difficult to choose between these scenarios on current data.

Aus dem Wissenschaftlichen übersetzt bedeuten die Worte der Autoren, dass, wenn wir die gesamte RBD der drei Stämme analysieren, die offensichtlichen Unterschiede (nicht synonyme Substitutionen) zwischen ihnen verworfen werden , die hauptsächlich auf RB M zurückzuführen sind (was, wie ich mich erinnere, zwischen CoV2 und Pangolin identisch ist), und bauen Phylogenetischer Baum durch synonyme Substitutionen, CoV2 ist dennoch näher an RaTG13 und nicht an dem Pangolin-Stamm. Was angesichts der Tatsache, dass die Pangoliniy mit CoV2 eine identische RBM aufweist (dh ein Segment innerhalb der RBD), ziemlich seltsam ist.

Die Autoren theoretisieren weiter, dass dies das Ergebnis einer konvergenten Evolution sein könnte, das heißt, dass Stämme von CoV2 und Pangolinen auf ihre eigene Weise und nicht durch gemeinsame Rekombination gemeinsamer Vorfahren zum identischen RBM gelangten. Weil es wirklich sehr seltsam war, dass eine Rekombination stattfinden musste - als hätte jemand einfach ein Stück RBM von einem Pangolin-Stamm genommen und es in RaTG13 durch RBM ersetzt. Und das ist nicht wie Evolution, aber verzeihen Sie Darwin, Intelligentes Design.

Genealogie der gekrönten Personen

Um den Ursprung von CoV2 besser zu verstehen, werfen wir einen weiteren Blick auf die Sequenz des Spike-Proteins in unserer Dreifaltigkeit: CoV2, RaTG13 und Pangolin - vergleichen Sie den paarweisen Unterschied zwischen ihnen (identische Aminosäuren sind mit Punkten markiert, rote Buchstaben zeigen den Unterschied an und Striche zeigen gelöschte / hinzugefügte Aminosäuren an). ::

Mit bloßem Auge ist zu erkennen, dass der Pangolinium-Stamm im ersten Viertel der Sequenz weit von CoV2 und RaTG13 entfernt ist. Nun, RaTG13 wäre ohne das Diagramm in der RBM-Region (rotes Rechteck) sooo nahe an CoV2. Aber wie ich bereits sagte, ist dieselbe Stelle in CoV2 dem Pangolin-Stamm am nächsten.

Was ist übrigens mit anderen Pangolin-Stämmen? Lassen Sie uns einen Blick darauf werfen. Schließlich haben wir bisher nur das Virus analysiert, das aus Pangolinen isoliert wurde, die 2019 vom Zoll beschlagnahmt wurden. Außerdem wurde 2017 eine Charge von Pangolinen beschlagnahmt, und es wurde auch ein ähnlicher Stamm isoliert. Wenn wir RaTG13 mit den Genomen von Viren aus den Pangolinen von 2017 und 2019 vergleichen, dann ist auch hier alles interessant:

Im ersten Quartal des S-Proteins sind Pangolin-Stämme aus dem Jahr 2017 näher an RaTG13 (und CoV2) als ihr Pangolin-Gegenstück aus dem Jahr 2019 (MP789). Gleichzeitig haben alle drei einen klaren gemeinsamen Vorfahren in den durch grüne Rechtecke hervorgehobenen Bereichen, und in diesen Bereichen sind RaTG13 und Pangolin-19 (MP789) näher als Pangolin-17, da es mehrere gemeinsame Mutationen mit RaTG13 aufweist (rot eingekreist) und blaue Ellipsen), die in der Legende-17 nicht beobachtet werden. Gleichzeitig ist das RBM für alle drei unterschiedlich und in ungefähr demselben Verhältnis und an ähnlichen Orten unterschiedlich.

Vielleicht ersetzte MP789 auch nach der Trennung der Vorfahren von RaTG13 und MP789 einen großen Teil des ersten Viertels des S-Proteins (das in RaTG13 und Pangolin-17 nicht vorkam), und der Rest des S-Proteins blieb allen drei gemeinsam. Und dann kamen die Pfade der RaTG13- und MP789-Genpools wieder zusammen und brachten in einem Anfall von Leidenschaft CoV2 hervor. Es ist auch möglich, dass der Vorfahr von RaTG13 das Ergebnis einer Rekombination der Vorfahren der Pangolin-Stämme ist.

Es ist auch interessant, die ziemlich einzigartige identische Mutation (QTQTNS) in RaTG13 und Pangolin-19 direkt vor der Stelle zu sehen, an der CoV2 eine neue Furin-Spaltstelle aufweist, die aufgrund der Insertion von 4 neuen Aminosäuren an dieser Stelle (PRRA) entstanden ist. Wenn Sie sich die Nukleotidsequenz um dieselbe Mutation ansehen, können Sie sehen, dass RaTG13 und CoV2 näher beieinander liegen als Pangolin-19, da sie mehrere häufige Mutationen akkumulieren konnten (blau hervorgehoben):

Übrigens hat CoV2 mit Orf1ab auch einen phylogenetischen Sprung: 1a ist näher an RaTG13, aber 1b ist näher an Pangolin-19:

Das heißt, es stellt sich heraus, dass der Vorfahr von CoV2 mindestens zweimal mit dem gemeinsamen Vorfahren von Pangolin-19 gesündigt hat? Zum ersten Mal - als er (zusammen mit einem gemeinsamen Vorfahren mit RaTG13) Orf1ab und den zweiten Teil des spike-ähnlichen Proteins mit der QTQTNS-Mutation erbte und zweitens - als er 1b mit RBM erwarb, das sich bereits von RaTG13-s unterscheidet. Nein, das ist natürlich möglich und an sich nicht besonders bemerkenswert - schließlich mutieren diese Viren und rekombinieren ständig. Eine andere Frage ist, wo genau die Fledermäuse und Pangolin-Viren für solche Orgien miteinander zu finden sind - in Berghöhlen, "feuchten Märkten", Tierheimen für beschlagnahmte Tiere oder sogar in Labors. Aber nehmen wir uns einen Moment Zeit mit diesen Fragen. Betrachten Sie zunächst den auffälligsten Aspekt des neuen Virus - eine Seitenleiste mit 4 Aminosäuren, die es zu einem Superkiller gemacht hat.

Ich treffe ordentlich, aber hart

Es ist völlig unmöglich, diese PRRA-Box zwischen S1 und S2 zu ignorieren. Als Splitter sticht es im Genom unseres neuen CoV2 hervor. Diese Box ist nicht einfach, aber golden. Sie schafft die Furin-Spaltstelle , die ich am Anfang erwähnt habe. Was für ein Biest ist das? Ich werde versuchen, es kurz zu erklären. Erinnern Sie sich an die Struktur unseres Spike-Proteins? Hier ist ein visuelles Diagramm:

Das Protein besteht aus zwei Teilen, S1 und S2, von denen S1 für den primären Kontakt mit dem Rezeptor (dieselbe Rezeptorbindungsdomäne / das gleiche Rezeptorbindungsmotiv) verantwortlich ist und S2 für die Fusion mit der Zellmembran und das Eindringen in die Zelle verantwortlich ist. Es startet den Fusionsprozess, der mit einem gelben Fusionspeptid markiert ist, aber um sein schmutziges Geschäft zu starten, muss jemand das S-Protein an einer der Stellen schneiden, die im obigen Diagramm durch Rauten hervorgehoben sind. Das Virus hat keine eigenen "Cutter" (es gibt andere, aber das ist irrelevant), so stützt er sich auf verschiedene Proteasen seiner Opfer, den Nutzen solcher Proteasen, wie Sie an der Fülle der Farben derselben Rauten verstehen können, gibt es verschiedene Arten. Aber nicht alle von ihnen sind gleich, und nicht alle Zelltypen haben die vom Virus benötigten Proteasen. Und Furin ist nur eines der effektivsten und lebt sogar nicht nur auf der Oberfläche von Zellen, sondern auch im Inneren. Am deutlichsten wird die Gefahr der neuen Furinstelle durch den Unterschied zwischen CoV2 und seinem „Vorläufer“ SARS-CoV gezeigt:

Wie aus dem Diagramm ersichtlich ist, können im Fall von CoV2 dank der Furinstelle nicht zwei, sondern drei Klassen von Proteasen (drei mehrfarbige Pacmen) sein S-Protein außerhalb der Zelle schneiden. Aber vielleicht ist der wichtigste Unterschied, dass Furin auch in der Zelle vorhanden ist, so dass es das S-Protein unmittelbar nach dem Zusammenbau des Virions schneiden kann, wodurch die Fähigkeit neuer Virionen erhöht wird, sich mit anderen Zellen zu verbinden - sozusagen ohne die Kasse zu verlassen.

Übrigens ist es wahrscheinlich, dass die neue Furinstelle eine wichtige Rolle bei der ausgeprägten altersabhängigen Morbidität und Mortalität von CoV2 spielt:

, , , , , SARS-CoV-2. () COVID-19 . SARS-CoV-2 , .
Patients with hypertension, diabetes, coronary heart disease, cerebrovascular illness, chronic obstructive pulmonary disease, and kidney dysfunction have worse clinical outcomes when infected with SARS-CoV-2, for unknown reasons. The purpose of this review is to summarize the evidence for the existence of elevated plasmin(ogen) in COVID-19 patients with these comorbid conditions. Plasmin, and other proteases, may cleave a newly inserted furin site in the S protein of SARS-CoV-2, extracellularly, which increases its infectivity and virulence.

Oh ja, es schneidet Furinproteine an genau definierten Stellen, nämlich nach der RxxR-Sequenz (dh Arg-XX-Arg, wobei X eine beliebige Aminosäure sein kann). Wenn Arginin ebenfalls an zweiter oder dritter Stelle steht (dh RRxR oder RxRR), steigt darüber hinaus die Spaltungseffizienz dieser Stelle signifikant an.

Daher wurde das Auftreten einer neuen Furinspaltungsstelle durch Spezialisten sofort bemerkt . Würde immer noch! Schließlich hat keiner der engsten oder sogar entferntesten Verwandten von Cov2 eine solche Stelle - die Coronaviren, die sie haben, sind Cov2 in Bezug auf das Genom nur zu 40% nahe:

Es wurde gefunden, dass alle Spike-Proteine mit einer SARS-CoV-2-Proteinhomologie von mehr als 40% keine Furin-Spaltstelle hatten (1, Tabelle 1), einschließlich Bat-CoV RaTG13 und SARS-CoV (mit einer Sequenzidentität von 97,4) % bzw. 78,6%). Die RRAR-Furinstelle in SARS-CoV-2 ist dank des einzigartigen PRRA-Einsatzes in seiner Familie einzigartig. Diese Stelle in SARS-CoV-2 hätte sich kaum aus MERS, HCoV-HKU1 usw. entwickeln können. Aus den derzeit verfügbaren Sequenzen in den Datenbanken ist es für uns schwierig, die Quelle zu finden. Vielleicht warten noch viele weitere evolutionäre Zwischensequenzen auf ihre Entdeckung.
Quellentext
It was found that all Spike with a SARS-CoV-2 Spike sequence homology greater than 40% did not have a furin cleavage site (Figure 1, Table 1), including Bat-CoV RaTG13 and SARS-CoV (with sequence identity as 97.4% and 78.6%, respectively). The furin cleavage site “RRAR” in SARS-CoV-2 is unique in its family, rendering by its unique insert of “PRRA”. The furin cleavage site of SARS-CoV-2 is unlikely to have evolved from MERS, HCoV-HKU1, and so on. From the currently available sequences in databases, it is difficult for us to find the source. Perhaps there are still many evolutionary intermediate sequences waiting to be discovered.

Hier ist eine klare Illustration aus demselben Artikel wie im obigen Zitat (Coronaviren mit einer Furinstelle sind rosa markiert, 3 verschiedene Cov2-Stämme sind um 10 Uhr gezeigt):

Der engste Verwandte mit der Furinstelle ist der HKU5-Stamm, der 2014 vom Shi Zhengli-Team in Guangzhou aus Fledermäusen der Gattung Pipistrellus isoliert wurde ( 2018 zur GenBank hinzugefügt ). Aber er ist ein sehr entfernter Verwandter - ihre spitzenartigen Proteine stimmen nur zu 36% überein.

Im Allgemeinen sind Wissenschaftler verwirrt. Woher kam dieses 12-Nucleotid-Insert? Könnte es von Menschen gemacht sein? Ganz. In der Tat haben sich Virologen wiederholt und seit jeher mit solchen Einsätzen befasst. Zum Beispiel Amerikaner eingeführt RRSRR in das Spike - Protein der ersten SARS-CoV im Jahr 2006 :

Um zu untersuchen, ob die proteolytische Spaltung an der Sequenz der Hauptaminosäurereste die Zellfusionsaktivität fördern kann, mutierten wir das spike-ähnliche SARS-CoV-Protein, um an einer von zwei Stellen eine Furin-Erkennungsstelle (RRSRR) zu erzeugen.
Quellentext
To investigate whether proteolytic cleavage at the basic amino acid residues, were it to occur, might facilitate cell–cell fusion activity, we mutated the wild-type SARS-CoV glycoprotein to construct a prototypic furin recognition site (RRSRR) at either position.

Und die Japaner haben 2008 eine solche Stelle (RRKR) in das SARS-CoV-Protein eingefügt , wenn auch etwas stromabwärts:

Im gleichen 2008. Jahr ihre niederländischen Kollegen auch untersucht diese Proteasestellen bei SARS-CoV und verglichen sie mit dem Maus - Coronavirus MHV, die diese Seite hat (SRRAHR | SV) außerdem ähnlich dem Gelände unserer COV2 (SPRRAR | SV):

Im Jahr 2009 beschloss eine andere amerikanische Gruppe , die „Verbesserung“ von SARS-CoV zu üben, und ohne die amerikanische Tradition zu ändern, nicht mit Argininen zu spielen, fügten sie RRSRR ein :

Um die mögliche Verwendung von SARS-CoV S1-S2- und S2'-Positionen als Stellen für die proteolytische Spaltung zu untersuchen, haben wir zuerst Furinspaltungserkennungsstellen an diesen Stellen eingeführt, indem wir die folgenden Mutationen 664-SLLRSTSQSI - SLL RRSRR SI-671 (S1-S2) und 792-LKPTKRSF-LKRTKRSF-799 (S2 ').
Quellentext
To examine the potential use of the SARS-CoV S1–S2 and S2? positions as sites for proteolytic cleavage, we first introduced furin cleavage recognition sites at these locations by making the following mutations 664-SLLRSTSQSI — SLLRRSRRSI-671 (S1–S2) and 792-LKPTKRSF — LKRTKRSF-799 (S2?).

Peking 2019

Die letzte ähnliche Arbeit, die ich gesehen habe, war die Arbeit von Wissenschaftlern aus Peking im Oktober 2019 , bei der die neue Furinstelle RRKR nicht in ein Pseudovirus, sondern in das echte Hühner-Coronavirus, das infektiöse Bronchitis-Virus (IBV), eingefügt wurde:

Übrigens ist die Erwähnung der Autoren interessant, dass die Zugabe einer Furinstelle es dem mutierten Virus ermöglicht, Nervenzellen zu infizieren. Möglicherweise ist die CoV2-Furinstelle der Grund, warum einige Patienten mit CoV2 neurologische Symptome aufweisen , einschließlich Geruchsverlust:

S2' QX , , IBV (WT-IBV). , IBV S2 ( -S2) . IBV .
…
, , FP CoV, , , -, , .
Mutation of the S2' site of QX genotype (QX-type) spike protein (S) in a recombinant virus background results in higher pathogenicity, pronounced neural symptoms and neurotropism when compared with conditions in wild-type IBV (WT-IBV) infected chickens. In this study, we present evidence suggesting that recombinant IBV with a mutant S2' site (furin-S2' site) leads to higher mortality. Infection with mutant IBV induces severe encephalitis and breaks the blood–brain barrier.
…
In summary, our results demonstrate that the furin cleavage site upstream of the FP in S protein is an important site for CoV, modulating entry, cell–virus fusion, adaptation to its host cell, cell tropism and pathogenicity, but not antigenicity.

Darüber hinaus haben viele Coronaviren natürlich Furinstellen, die in der Natur vorkommen, und sie sind sehr vielfältig. Ja, und sie können als Ergebnis zufälliger Mutationen auftreten. Genau dies geschah im Fall von MERS, das uns 2015 von einem internationalen Autorenteam mitgeteilt wurde , darunter Shi Zhengli und Ralph Barik, zwei Stars der synthetischen Koronavirusologie. Wir werden sie mehr als einmal zurückrufen, aber vorerst ein paar Worte zu diesem Artikel. Tatsächlich zeigten die Autoren zwei Schlüsselmutationen, die es MERS ermöglichten, von Fledermäusen zu Menschen zu springen. Und eine dieser Mutationen führte zur Entstehung einer Furinstelle. Dies war zwar keine Schachtel mit neuen Aminosäuren, sondern Mutationen zuvor vorhandener (unten rot markiert):

Die Autoren zeigten nicht nur, sondern banden diese Mutationen wieder an das ursprüngliche Fledermaus-Spike-Protein an, wobei dieselben Mutationen darin (dh die Furinstelle) erzeugt wurden, und zeigten, dass dies die Fähigkeit gibt, menschliche Zellen zu infizieren:

, HKU4 , HKU4, . , S746R N762A, HKU4.
…
, hPPC hECP HKU4 HKU4 . , HKU4 S1/S2, .
To evaluate the potential genetic changes required for HKU4 to infect human cells, we reengineered HKU4 spike, aiming to build its capacity to mediate viral entry into human cells. To this end, we introduced two single mutations, S746R and N762A, into HKU4 spike. The S746R mutation was expected to restore the hPPC motif in HKU4 spike, whereas the N762A mutation likely disrupted the potential N-linked glycosylation site in the hECP motif in HKU4 spike.
…
Therefore, the reengineered hPPC and hECP motifs enabled HKU4 spike to be activated by human endogenous proteases and thereby allowed HKU4 pseudoviruses to bypass the need for exogenous proteases to enter human cells. These results reveal that HKU4 spike needs only two single mutations at the S1/S2 boundary to gain the full capacity to mediate viral entry into human cells.

Übrigens kann die Art und Weise, wie sie dies taten, Menschen erschrecken, die weit von der modernen Biotechnologie entfernt sind - denn die Autoren haben dieses Coronavirus-Spike-ähnliche Protein in inaktiviertes Retrovirus (HIV) eingefügt:

Kurz gesagt wurden pseudotypisierte MERS-CoV-Spike-Retroviren, die das Luciferase-Reportergen exprimieren, durch Cotransfektion von HEK293T-Zellen mit einem Plasmid erhalten, das das HIV-1-Gen, Env-defekte exprimierende Luciferase (pNL4-3.luc.RE-) und ein für MERS kodierendes Plasmid trägt -CoV-Spike-Protein.
Quellentext
Briefly, MERS-CoV-spike-pseudotyped retroviruses expressing a luciferase reporter gene were prepared by cotransfecting HEK293T cells with a plasmid carrying Env-defective, luciferase-expressing HIV-1 genome (pNL4–3.luc.R-E-) and a plasmid encoding MERS-CoV spike protein.

Vielleicht ist es das , was die indischen Forscher aufgefordert , die Suche nach Sequenzen ähnlich in HIV und COV2 im Genom (aber ihre Preprint wurde schnell kritisiert für die erfolglose Methodik und falsche Schlussfolgerungen). In der Tat verwenden Experten solche Pseudoviren regelmäßig, und im Allgemeinen sollte es nicht gleichgültig sein, Retroviren als Klasse zu fürchten - ihre Unterart Lentiviren werden seit vielen Jahren für die Gentherapie verwendet .

Woher kam RaTG13?

Im Allgemeinen ist RaTG13 eine phänomenale Belastung. Es ist seltsam, dass Shi Zhenglis Gruppe all die Jahre über ihn geschwiegen hat. Schließlich ähnelt er seinen anderen Brüdern überhaupt nicht, insbesondere in der Sequenz des spike-ähnlichen Proteins, und dies ist, wie ich mich erinnere, genau der Ort, an dem bestimmt wird, an welchen Zelltypen (und an welchen Typen) sich dieses Virus festhalten kann. Hier ist ein Diagramm der Ähnlichkeit des CoV2-Genoms mit anderen Fledermaus-Coronaviren (Tafel B):

RaTG13 ist die rote Kurve und Blau ist die Stämme, die RaTG13 am nächsten kommen (ZXC21 und ZC45). Diese Stämme wurden 2015 ( ZXC21 ) und 2017 ( ZC45 ) aus chinesischen Hufeisen ( Rhinolophus sinicus ) in Zhoushan isoliert . Wie aus der Grafik ersichtlich ist, unterscheiden sie sich sogar sehr stark von RaTG13 (rote Kurve) im Bereich des S-Proteins. Gleichzeitig vermittelt die obige Grafik den Maßstab des Abgrunds zwischen ihnen nicht so gut wie einen direkten Vergleich von Sequenzen:

Wie Sie sehen können, sind die spike-ähnlichen Proteine ZXC21 und ZC45 nicht nur im Allgemeinen 23 bis 24 Aminosäurereste kürzer als das RaTG13-Protein, sondern sie sind an der wichtigsten Stelle - in RBM - kürzer (siehe Deletionen in der roten Box mit roten Strichen).

Woher kam der RaTG13? Wie ich bereits sagte, sagte Shi Zhengli im Juli 2013 in Yunnan , dass sie es aus Hufeisenfledermäusen (nur die Art Rhinolophus affinis , nicht R. sinicus ) isoliert habe . Zwar wurde bis Ende Januar 2020 nicht öffentlich über seine Existenz berichtet, aber wie die Gruppe Shi Zhengli selbst ihre bedeutende Entdeckung über ihre Ähnlichkeit mit CoV2 beschreibt :

, - - (RdRp) (BatCoV RaTG13), Rhinolophus affinis , 2019-CoV2. ( GISAID EPI_ISL_402131). Simplot , 2019-CoV2 RaTG13 (Fig. 1c), 96,2%.
We then found that a short region of RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) from a bat coronavirus (BatCoV RaTG13) — which was previously detected in Rhinolophus affinis from Yunnan province — showed high sequence identity to 2019-CoV2. We carried out full-length sequencing on this RNA sample (GISAID accession number EPI_ISL_402131). Simplot analysis showed that 2019-CoV2 was highly similar throughout the genome to RaTG13 (Fig. 1c), with an overall genome sequence identity of 96.2%.

Nicht dick: Nun, sie hatten diese Sorte "zuvor entdeckt" , und das war es auch. Auf einem Regal liegen. Bis 2020 wurde nur der Teil des Genoms, der für RdRp verantwortlich ist, darin sequenziert. Woher kam er im Regal? In Yunnan im Jahr 2013 zugeteilt. Wo genau? Sie sagten es nicht. Auch in der GenBank gab es diese Informationen nicht. Glücklicherweise gab es eine GISAID in der Genomdatenbank: Es wird berichtet, dass in der Stadt Puer (ja, in der Heimat von Bastas geliebtem Tee) ein Mann aus dem Kotabstrich isoliert wurde:

Das faszinierte mich ein wenig, denn bei meinen Wanderungen durch Pabmed war ich bereits im Sommer 2013 auf eine Expedition nach Puer gestoßen :

Von Mai bis Juli 2013 wurden Fledermäuse an verschiedenen Orten in fünf Distrikten der vier Präfekturen von Yunnan, China, gefangen.
Quellentext
Bats were captured from various locations in five counties of four prefectures of Yunnan Province, China, from May to July 2013.

Die Forscher fanden auf dieser Expedition nichts besonders Interessantes für uns, aber vielleicht identifizierte Shi Zhengli (oder jemand aus ihrer Gruppe?) Die gleiche RaTG13-Probe? Was sie nur teilweise sequenzierten, aber aus irgendeinem Grund beschlossen, nicht zu veröffentlichen, obwohl es sich sehr von allem unterschied, was bisher bekannt war.

Shi Zhengli selbst könnte durchaus persönlich an dieser Expedition teilnehmen, da sie sehr herzlich über solche Expeditionen sprach - zum Beispiel in ihrer TED-ähnlichen Aufführung im Jahr 2018, in der sie ihre Fotos von solchen Expeditionen zeigte:

Es war eine Reihe solcher Expeditionen, die ihr weltweiten Ruhm und den Spitznamen „Batumen“ einbrachten: In einem Artikel in Nature aus dem Jahr 2013 gab die Shi Zhengli-Gruppe triumphierend bekannt, dass sie in den Höhlen von Yunnan Trägerfledermäuse der Stämme RsSHC014 und Rs3367 entdeckt hatte, die mit dem ersten SARS zusammenfielen -CoV um 85% bzw. 96%.

Übrigens ist es ein lustiger Zufall, dass die Shi Zhengli-Gruppe ungefähr zur gleichen Zeit im gleichen Yunnan auch den RaTG13-Stamm fand, der sich als am nächsten an CoV2 herausstellte, und dass ihre Genome ebenfalls zu 96% übereinstimmen.

Wuhan-1

Um auf diesen triumphalen Artikel aus dem Jahr 2013 zurückzukommen, sagte Shi Zhenglis Gruppe auch, dass es ihnen durch Kultivierung der isolierten Proben in Vero- Affenzellkultur gelungen sei, ein lebendes Virus zu isolieren, das fast identisch mit dem Stamm Rs3367 war (am nächsten an SARS-CoV). . Die Autoren nannten ihre Nachkommen WIV1 (wobei WIV für Wuhan Institute of Virology steht):

Am wichtigsten ist, dass wir über die erste Isolierung des lebenden Virus SL-CoV (Fledermaus SL-CoV-WIV1) aus Proben berichten, die aus Fledermauskot in Vero E6-Zellen isoliert wurden, die eine typische Morphologie des Coronavirus aufweisen und eine Genomidentität von 99,9% aufweisen Rs3367 und verwendet ACE2-Personen, Zibet- und Hufeisenknochen, um die Zelle zu betreten. Vorläufige In-vitro-Tests zeigen, dass WIV1 auch einen breiten Arten-Tropismus aufweist.
Quellentext
Most importantly, we report the first recorded isolation of a live SL-CoV (bat SL-CoV-WIV1) from bat faecal samples in Vero E6 cells, which has typical coronavirus morphology, 99.9% sequence identity to Rs3367 and uses ACE2 from humans, civets and Chinese horseshoe bats for cell entry. Preliminary in vitro testing indicates that WIV1 also has a broad species tropism.

Vergleichen wir RaTG13 mit den Stämmen Rs3367 und RsSHC014:

Wie Sie sehen können, ist das spike-ähnliche Protein dieser Stämme nicht nur kürzer als 13 Aminosäuren RaTG13-shn, sondern unterscheidet sich auch in seinem ersten Quartal stark. Übrigens ist es merkwürdig, dass die Spike-Proteine in Rs3367 (auch bekannt als WIV1) und RsSCH014 nahezu identisch sind und sich nur in der RBD-Region unterscheiden (rechte Sequenz unten). Fast wie CoV2 und RaTG13 (ohne Furineinsatz):

Könnte ein Forscher, der im März 2019 Coronavirus-Proben von vom Zoll beschlagnahmten Pangolinen erhalten hat, überprüfen wollen, wie tropisch RBM-Pangolinium für den menschlichen Rezeptor ist? Und was ist, wenn mit einer mehrbasischen Furin-Stelle am interessantesten Ort? Dies wird eine Bombe sein!

Theoretisch könnte er das natürlich. Für Virologen ist es technisch nicht schwierig, solche Experimente durchzuführen. Eine vernünftige Frage: Warum sollten sie RaTG13 als Basis verwenden und WIV1 noch nicht getestet haben? Es ist aber möglich, dass sie auch die Chimäre mit WIV1 getestet haben. Parallel dazu beschlossen sie, die Variante der Rekombination des Pangolin-Virus mit der Fledermaus näher zu simulieren - schließlich ist RaTG13 näher an den Pangolin-Stämmen als WIV1: sein spike-ähnliches Protein ist ihnen sowohl phylogenetisch als auch strukturell näher - es entspricht sogar ihrer Länge, während die Proteine WIV1 / Rs3367 und RsSHC014 13 Aminosäuren kürzer als Pangolin. Und die QTQTNS-Mutation, die RaTG13 und Pangolin-19 (MP789) im Bereich der Protease-Stelle gemeinsam haben, kann den Spezialisten nicht gleichgültig lassen.

Andere Yunnan-Stämme

Übrigens fanden 2011 auch andere Forscher Proben von Coronaviren aus dem Yunnan Rhinolophus affinis . Der Stamm LYRa11 schien mir am interessantesten:

Es ist aber auch sehr weit von RaTG13 entfernt und viel näher an Rs3367 (dies ist der Stamm, der zu 96% mit dem ersten SARS-CoV übereinstimmt):

Aber RaTG13, isoliert aus den gleichen Fledermäusen von Rhinolophus affinis wie LYRa11, sieht am wenigsten danach aus (linke Explosion).

Und schließlich ähnelt ein anderer Yunnan-Stamm (genial Yunnan2011 genannt), der 2011 aus einer anderen Unterart der Hufeisenrasse, Rhinolophus pusillus , isoliert wurde , RaTG13 noch weniger als LYRa11:

Ja, und untereinander sind Yunnan2011 und LYRa11 (die rechte Explosion oben) nicht besonders ähnlich, abgesehen von der hochkonservierten Region S2. Übrigens, was für ein Durcheinander haben sie mit den Namen der Stämme? Zuerst verschreiben sie es das ganze Jahr, manchmal teilweise oder gar nicht (Rs3367). Zuerst kommt der Trägertyp ( Ra TG13), dann später (LY Ra 11). Sie fragen sich immer noch, was TG, LY oder SHC bedeuten? Initialen, die das Genom entschlüsseln?

Okay, lassen Sie uns von der viralen Archäologie zur viralen Technik übergehen, nämlich zur Transplantation von Schlüsselbereichen des Spike-Proteins und anderen Experimenten zum Funktionsgewinn (GOF).

1999: Erstes chimäres Coronavirus

Wenn Sie glauben, dass all diese GOF-Motoren mit der Analyse, was genau Coronaviren erlaubt, von einer Art zur anderen zu springen, als Reaktion auf die Epidemie des ersten SARS im Jahr 2002 begonnen haben, irren Sie sich. Virologen experimentierten lange zuvor mit chimären Coronaviren. Hier zum Beispiel ist ein Beispiel Artikel aus dem Jahr 1999 von der niederländischen Gruppe von Peter Rottier von Utrecht mit dem Sprechen „Retargeting corona durch die Ektodomäne in dem Spike - Protein zu ersetzen: Überquerung die Speziesbarriere“:

Unter Verwendung einer gerichteten RNA-Rekombination konstruierten wir eine Mutante des Coronavirus-Maus-Hepatitis-Virus (MHV), bei der die wirbelsäulenförmige Ektodomäne durch die stark divergierende Ektodomäne des infektiösen Peritonitis-Virus-Proteins der Katze ersetzt wurde. Das resultierende chimäre Virus, das als fMHV bezeichnet wird, erwarb die Fähigkeit, Katzenzellen zu infizieren, und verlor gleichzeitig die Fähigkeit, Mauszellen in Kultur zu infizieren.
Quellentext
Using targeted RNA recombination, we constructed a mutant of the coronavirus mouse hepatitis virus (MHV) in which the ectodomain of the spike glycoprotein (S) was replaced with the highly divergent ectodomain of the S protein of feline infectious peritonitis virus. The resulting chimeric virus, designated fMHV, acquired the ability to infect feline cells and simultaneously lost the ability to infect murine cells in tissue culture.

Shi Zhengli scheint übrigens ein Praktikum bei Peter Rottier in Utrecht gehabt zu haben. Zumindest im Jahr 2005 war sie Mitautorin eines gemeinsamen Artikels, in dem Utrecht als ihr Partner aufgeführt wurde (die aktuelle Adresse wurde jedoch bereits am Shanghai Institute angegeben). Übrigens ist der Artikel selbst auch sehr merkwürdig - darin untersuchten die Autoren, was genau es Viren ermöglicht, ihren Arten-Tropismus zu erweitern:

Nur eine geringe Anzahl von Mutationen in seinem spike-ähnlichen Protein ermöglicht es dem Maus-Coronavirus, durch In-vitro-Passivierung von mausbegrenztem Tropismus zu einem erweiterten Wirtsbereich zu wechseln. Ein solches von uns untersuchtes Virus erwarb zwei mutmaßliche Heparansulfat- Bindungsstellen , während die Furinstelle an anderer Stelle erhalten blieb.
Quellentext
Only a relatively few mutations in its spike protein allow the murine coronavirus to switch from a murine-restricted tropism to an extended host range by being passaged in vitro. One such virus that we studied had acquired two putative heparan sulfate-binding sites while preserving another site in the furin-cleavage motif.

Erstens ist es interessant, dass die Furinstelle in diesem Virus (SRRAHR | SV) der Stelle in CoV2 (SPRRAR | SV) ähnlich ist, obwohl sie in CoV2 aufgrund von doppelten Argininen effizienter schneidet (dies macht es zu einer polybasischen Stelle, d.h. er hat mehrere basische Aminosäuren in einer Reihe in der RxxR-Sequenz ):

Der Artikel ist jedoch besonders merkwürdig, dass die Mutationen, die es dem Virus ermöglichten, „seinen Horizont zu erweitern“, nicht einmal bei Labortieren auftraten , sondern in vitro ( indem sie in vitro passagiert wurden ). Und anscheinend sind sie ziemlich schnell gegangen:

MHV/pi23 — , 23 600 , MHV/BHK, HS- S1 , MHV/BHK, , HS- . MHV/pi23 , , MHV/BHK. HS- , , , S, HR1 (Fig. 1), . S, .
MHV/pi23, a virus obtained after 23 of the 600 passages that resulted in MHV/BHK, also contains a putative HS-binding site in the S1 domain at the same position as in MHV/BHK, albeit as a smaller insertion, while it lacks the putative HS-binding site immediately upstream of the fusion peptide. MHV/pi23 does infect nonmurine cells to some extent but much less efficiently than MHV/BHK. In addition to the multiple HS-binding sites, however, mutations found in other parts of the S protein, such as the HR1 domain and the putative fusion peptide (Fig. 1), might also contribute to the efficient entry into nonmurine cells. We are currently in the process of determining the S protein mutations that are required for the extended host range phenotype.

Mit Blick auf die Zukunft möchte ich erwähnen, dass es andere Gruppen gab, die In-vitro-Mutationen versuchten, um die Virulenz des Coronavirus zu erhöhen, beispielsweise MERS:

Um die Anpassungsfähigkeit von MERS-CoV-Spezies besser zu verstehen, verwendeten wir die suboptimale DPP4-Variante, um die Virusanpassung zu untersuchen. Die Passage des Virus auf Zellen, die diese DPP4-Variante exprimieren, führte zur Akkumulation von Mutationen im viralen Spike-Protein, was die Replikation erhöhte.
Quellentext
To better understand the species adaptability of MERS-CoV, we identified a suboptimal species-derived variant of DPP4 to study viral adaption. Passaging virus on cells expressing this DPP4 variant led to accumulation of mutations in the viral spike which increased replication.

Darüber hinaus traten ihre Mutationen bereits nach mehreren Passagen (Reproduktionsrunden von Zellkulturen) auf:

(F) Schema des Auftretens von Einzel- und Doppelmutationen im MERS-CoV-Spike-Protein in verschiedenen Passagen.
(G) Ort der Mutationen im MERS-CoV-Spike-Protein.
Quellentext
(F) Schematic of single and double mutation emergence in MERS-CoV spike over different passages.
(G) Location of mutations within MERS-CoV spike.

Aber das alles wird viel später sein. Kommen wir in der Zwischenzeit zurück zu 2002 - VOR dem Ausbruch des ersten SARS-CoV.

Wie Barik allen den Weg ebnete

Ralph Barik ist eine Legende in der Koronavirusologie. Ein wahrer Pionier in der Manipulation synthetischer viraler Genomtechniken. Bereits im Jahr 2002 veröffentlichte er eine bahnbrechende Arbeit, die einen neuen Meilenstein sowohl bei der Untersuchung verschiedener Mechanismen natürlicher Viren als auch bei der Funktionsgewinnforschung (GOF) eröffnete. In ihrer Arbeit hat Bariks Gruppe einen Klon des natürlichen Maus-Coronavirus synthetisch nachgebildet:

II 59 (MHV-A59). , MHV 31,5 . , MHV-A59 ~ 31,5 ... , , , … , , .
Quellentext
A novel method was developed to assemble a full-length infectious cDNA of the group II coronavirus mouse hepatitis virus strain A59 (MHV-A59). Seven contiguous cDNA clones that spanned the 31.5-kb MHV genome were isolated. The ends of the cDNAs were engineered with unique junctions and assembled with only the adjacent cDNA subclones, resulting in an intact MHV-A59 cDNA construct of ?31.5 kb in length. The interconnecting restriction site junctions that are located at the ends of each cDNA are systematically removed during the assembly of the complete full-length cDNA product, allowing reassembly without the introduction of nucleotide changes… The method has the potential to be used to construct viral, microbial, or eukaryotic genomes approaching several million base pairs in length and used to insert restriction sites at any given nucleotide in a microbial genome.

Das heißt, die Autoren übersetzten das RNA-Virus tatsächlich in die Sprache der DNA (unter Verwendung der reversen Transkriptase), so dass es für sie zweckmäßig wäre, sein Genom unter Verwendung vorhandener gentechnischer Werkzeuge zu manipulieren. Nachdem die Autoren 7 solcher cDNA-Provirus-Segmente erstellt hatten, nähten sie sie „nahtlos“ zusammen (ohne Spuren zu hinterlassen), wonach sie ihr Konstrukt zurück auf RNA übertrugen, aus der sich dann Viruspartikel in anderen Zellen bildeten.

SARS-2003

Nur wenige Wochen nach der Veröffentlichung dieser Arbeit durch Bariks Gruppe schlug die SARS-CoV- Epidemie ein , und Ralph Barik verschwendete keine Zeit. Bereits im Sommer 2003 schickte seine Gruppe die Arbeit zur Erstellung eines synthetischen Klons SARS-CoV zum Drucken :

, , SARS-CoV Urbani SARS ( SARS-CoV), , . , , … SARS-CoV , .
Using a panel of contiguous cDNAs that span the entire genome, we have assembled a full-length cDNA of the SARS-CoV Urbani strain, and have rescued molecularly cloned SARS viruses (infectious clone SARS-CoV) that contained the expected marker mutations inserted into the component clones. Recombinant viruses replicated as efficiently as WT virus and both were inhibited by treatment with the cysteine proteinase inhibitor… Availability of a SARS-CoV full-length cDNA provides a template for manipulation of the viral genome, allowing for the rapid and rational development and testing of candidate vaccines and therapeutics against this important human pathogen.

Die Geschwindigkeit der Barik-Gruppe ermöglicht es uns zu verstehen, wie schnell ein qualifiziertes Team von Virologen einen synthetischen Klon aus einem natürlichen Virus erstellen und daher genetische Änderungen daran vornehmen kann. Und es war im Jahr 2003. Heute kann sich das gleiche qualifizierte Labor in wenigen Wochen wiederholen.

SARS-2006

Barik war der erste, aber weit vom letzten entfernt. Die Gentechnik hat sich sprunghaft weiterentwickelt und immer mehr neue Werkzeuge geschaffen. Andere Gruppen praktizierten alternative Technologien für die synthetische Virologie. Zum Beispiel wiederholten spanische Forscher 2006 die Errungenschaften von Barik und schufen ebenfalls einen synthetischen SARS-Klon , verwendeten jedoch eine andere Technologie ( künstliches Bakterienchromosom ):

Urbani SARS-CoV (BAC). . , Escherichia coli.
…
SARS-CoV E.coli DH10B 200 , ( ). .
The engineering of a full-length infectious cDNA clone and a functional replicon of the severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) Urbani strain as bacterial artificial chromosomes (BACs) is described in this study. In this system, the viral RNA was expressed in the cell nucleus under the control of the cytomegalovirus promoter and further amplified in the cytoplasm by the viral replicase. Both the infectious clone and the replicon were fully stable in Escherichia coli.
…
The assembled SARS-CoV infectious cDNA clone was fully stable during its propagation in E. coli DH10B cells for more than 200 generations, considerably facilitating the genetic manipulation of the viral genome (data not shown). The detailed cloning strategy, plasmid maps, and sequences are available upon request.

Sie machten es zwar nicht so elegant wie Barik, weil sie bei der Endmontage des synthetischen Virus noch Restriktionsenzymstellen hinzugefügt hatten, während Barik lernte, die Fragmente "nahtlos" zu kombinieren. Aber das sind Kleinigkeiten, der spanische Ansatz funktioniert auch ziemlich gut - 2013 haben sie mit ihrer Hilfe einen synthetischen Klon von MERS-a erstellt , und 2015 wurde ihre Technik in den Coronavirus-Lehrbuchführer aufgenommen (Kapitel 13):

Wuhan 2007

Aber schon 2007. Dann schloss sich die Shi Zhengli-Gruppe dem Rennen um synthetische Virologie an und untersuchte das spike-ähnliche Protein von Coronaviren von Menschen und Fledermäusen, um herauszufinden, was genau für die Fähigkeit verantwortlich ist, von Art zu Art zu springen:

Eine Anzahl von chimären Spike-Proteinen wurde durch Insertion verschiedener SARS-CoV-Spike-Proteinsequenzen in das Rückgrat des SL-CoV-Proteins konstruiert.
Quellentext
A series of S chimeras was constructed by inserting different sequences of the SARS-CoV S into the SL-CoV S backbone.

Das heißt, die Autoren fügten verschiedene Segmente des menschlichen SARS-CoV-Proteins in das Protein des Fledermausvirus ein. Hier ist ihre Schlussfolgerung:

Aus diesen Ergebnissen wurde herausgefunden, dass die Region von 310 bis 518 im Spike-Protein BJ01 notwendig und ausreichend war, um die Fähigkeit des Spike-Proteins Rp3 zu erhalten, an menschliches ACE2 zu binden.
Quellentext
From these results, it was deduced that the region from aa 310 to 518 of BJ01-S was necessary and sufficient to convert Rp3-S into a huACE2-binding molecule.

Gleichzeitig versuchten sie, kürzere Fragmente zu ersetzen, darunter nur RBM:

Um RBM von SARS-CoV in das SL-CoV-Spike-Protein einzufügen, wurde die codierende Region von 424 bis 494 Aminosäuren im Spike-Protein BJ01 verwendet, um die entsprechenden Regionen im Rp3-Protein zu ersetzen, was zu einem chimären Spike-Protein-Gen (CS) führte, das als CS424 bezeichnet wurde –494.
Quellentext
For introduction of the RBM of SARS-CoV S into the SL-CoV S, the coding region from aa 424 to 494 of BJ01-S was used to replace the corresponding regions of Rp3-S, resulting in a chimeric S (CS) gene designated CS424–494.

Angesichts der Tatsache, dass es 2007 geschrieben wurde, denke ich, dass es heute selbst für einen unerfahrenen Virologen nicht schwierig sein wird, das RBM eines Virus durch ein anderes zu ersetzen.

Chimäre 2015

In Anbetracht der obigen Experimente ist nicht sehr klar, was genau die Empfindung verursacht hat, die die wahrscheinlich sensationellste Veröffentlichung mit Funktionsgewinn erzeugt hat. Hier geht es natürlich um die gemeinsame Arbeit von Shi Zhengli und Ralph Barik, bei der sie ein synthetisches chimäres Virus geschaffen haben:

SARS-CoV, , SHC014 SARS-CoV. , 2b, SHC014 , SARS (ACE2), in vitro, SARS-CoV. , in vivo . ; , CoV . SHC014 in vitro, in vivo.
Quellentext
Using the SARS-CoV reverse genetics system, we generated and characterized a chimeric virus expressing the spike of bat coronavirus SHC014 in a mouse-adapted SARS-CoV backbone. The results indicate that group 2b viruses encoding the SHC014 spike in a wild-type backbone can efficiently use multiple orthologs of the SARS receptor human angiotensin converting enzyme II (ACE2), replicate efficiently in primary human airway cells and achieve in vitro titers equivalent to epidemic strains of SARS-CoV. Additionally, in vivo experiments demonstrate replication of the chimeric virus in mouse lung with notable pathogenesis. Evaluation of available SARS-based immune-therapeutic and prophylactic modalities revealed poor efficacy; both monoclonal antibody and vaccine approaches failed to neutralize and protect from infection with CoVs using the novel spike protein. On the basis of these findings, we synthetically re-derived an infectious full-length SHC014 recombinant virus and demonstrate robust viral replication both in vitro and in vivo.

Das heißt, die Forscher befanden sich bereits auf dem ausgetretenen Pfad: Sie nahmen das spike-ähnliche Protein aus RsSHC014, das Shi Zhengli 2011 aus Yunnan-Fledermäusen isolierte, und setzten es für nachfolgende In-vivo- Experimente in SARS-CoV ein, das speziell für das Kriechen von Mäusen angepasst war auf genau diesen Mäusen. Nun, an menschlichen Zellen wurde ein neues Design getestet. Gleichzeitig haben wir geübt, einen rekombinanten Klon mit demselben RsSHC014 zu erstellen - warum nicht? Immerhin ist es schön:

(a) Schema des molekularen Klons SHC014-CoV, der in Form von sechs zusammenhängenden cDNA-Segmenten (bezeichnet als SHC014A, SHC014B, SHC014C, SHC014D, SHC014E und SHC014F) synthetisiert wurde, flankiert von einzigartigen BglI-Restriktionsenzymstellen, die eine gerichtete Assemblierung für DNA bereitstellten 1a, 1b, Spike, 3, Hülle, Matrix, 6–8 und Nucleocapsid). Unterstrichene Nukleotide sind hervorstehende Sequenzen, die nach dem Restriktionsenzymverdau gebildet werden.
Quellentext
(a) Schematic of the SHC014-CoV molecular clone, which was synthesized as six contiguous cDNAs (designated SHC014A, SHC014B, SHC014C, SHC014D, SHC014E and SHC014F) flanked by unique BglI sites that allowed for directed assembly of the full-length cDNA expressing open reading frames (for 1a, 1b, spike, 3, envelope, matrix, 6–8 and nucleocapsid). Underlined nucleotides represent the overhang sequences formed after restriction enzyme cleavage.

Und zweitens stellten die Forscher fest, dass nicht nur durch die Zapfenbeschaffenheit des spike-ähnlichen Proteins zum Rezeptor das Potenzial des Virus für den Übergang von einer Tierart zur anderen bestimmt wird, da die SHC014-MA15-Chimäre selbst in menschlichen Zellen virulenter war als SHC014 selbst:

Es ist bemerkenswert, dass der unterschiedliche Tropismus in der Lunge im Vergleich zu SARS-MA15 und die Schwächung von SHC014-CoV in voller Länge in Kulturen [menschlichen epithelialen Atemwegen] im Vergleich zu SARS-CoV Urbani darauf hindeuten, dass neben der Bindung an ACE2 auch andere Faktoren - einschließlich der Prozessivität des Spike-Proteins , Bioverfügbarkeit des Rezeptors oder Antagonismus der Immunantworten des Wirts - kann zur Virulenz beitragen.
Quellentext
Notably, differential tropism in the lung as compared to that with SARS-MA15 and attenuation of full-length SHC014-CoV in [human epithelial airway cell] cultures relative to SARS-CoV Urbani suggest that factors beyond ACE2 binding — including spike processivity, receptor bio-availability or antagonism of the host immune responses — may contribute to emergence.

Ich möchte insbesondere die Prozessivität des Spike-Proteins im Zitat hervorheben, da dies nicht das erste Mal ist, dass Forscher schreiben, dass die Fähigkeit des Spike-Proteins, Proteasen (einschließlich Furin) zu spalten, einen signifikanten Einfluss auf die Virulenz hat.

Abschließend ist das Thema ein gemeinsames Foto von Ralph Barik und Shi Zhengli. Foto aufgenommen in Wuhan im Oktober 2018:

Maus SARS-2007

Hier kann ich nicht anders, als zu erwähnen, um welche Art von "Mausvirus MA15" es sich in einer früheren Arbeit handelte. Dies ist überhaupt keine Art von natürlichem Maus-Coronavirus, wie man vermuten könnte. Und dies ist ein labormodifiziertes menschliches SARS-CoV, das 2007 von derselben Barik-Gruppe - anscheinend im Wettbewerb mit der Shi Zhengli-Gruppe (erinnern Sie sich an ihren Artikel aus dem Jahr 2007) - zu einem echten Mörder wurde . Zu diesem Zweck "verbesserten" sie sich zunächst iterativ an Mäusen, und als sie nach mehreren Iterationen maximal "wirksam" wurden, reproduzierten sie die Mutationen, die bei Mäusen im synthetischen Klon eines neuen Virus auftraten, und überprüften erneut, ob es tatsächlich die Infektiosität erhöht hat:

SARS-CoV ( Urbani) BALB/c. (MA15), . , , , . , . , , 15, , . MA15 , ; SARS-CoV (rMA15), MA15. 15 , SARS .
We adapted the SARS-CoV (Urbani strain) by serial passage in the respiratory tract of young BALB/c mice. Fifteen passages resulted in a virus (MA15) that is lethal for mice following intranasal inoculation. Lethality is preceded by rapid and high titer viral replication in lungs, viremia, and dissemination of virus to extrapulmonary sites accompanied by lymphopenia, neutrophilia, and pathological changes in the lungs. Abundant viral antigen is extensively distributed in bronchial epithelial cells and alveolar pneumocytes, and necrotic cellular debris is present in airways and alveoli, with only mild and focal pneumonitis. These observations suggest that mice infected with MA15 die from an overwhelming viral infection with extensive, virally mediated destruction of pneumocytes and ciliated epithelial cells. The MA15 virus has six coding mutations associated with adaptation and increased virulence; when introduced into a recombinant SARS-CoV, these mutations result in a highly virulent and lethal virus (rMA15), duplicating the phenotype of the biologically derived MA15 virus. Intranasal inoculation with MA15 reproduces many aspects of disease seen in severe human cases of SARS.

-2008

Apropos Rivalität zwischen Barik und Shi Zhengli. Parallel zur Transplantation von RBD von humanem SARS-CoV auf Maus erzeugte seine Gruppe die gleichen Chimären mit Fledermausstämmen. Im Jahr 2008 nahm Bariks Gruppe den Bat-SCoV-Stamm und ersetzte ihn durch RBD in einem Spike-Protein mit RBD aus menschlichem SARS. Das heißt, sie wiederholte die Arbeit von Shi Zhengli aus dem Jahr 2007 und beschränkte sich nicht nur auf Pseudoviren, sondern schuf auch ein echtes chimäres Coronavirus - nicht nur ein murines wie in der Arbeit von 2015, sondern das menschlichste. Die Autoren waren eindeutig stolz auf ihre Leistung:

, 29,7 — (Bat-SCoV), (SARS), SARS-CoV.
…
, RBDs Bat-SCoV SARS-CoV , RBD Bat-SCoV ( 323–505) RBD SARS-CoV ( 319–518) (27, 28) (GenBank FJ211860), , in vivo (Fig. 1B).
Here, we report the design, synthesis, and recovery of the largest synthetic replicating life form, a 29.7-kb bat severe acute respiratory syndrome (SARS)-like coronavirus (Bat-SCoV), a likely progenitor to the SARS-CoV epidemic.
…
To test whether the RBDs of Bat-SCoV and SARS-CoV were interchangeable, we replaced the Bat-SCoV RBD (amino acid 323–505) with the SARS-CoV RBD (amino acid 319–518) (27, 28) (GenBank accession no. FJ211860), simulating a theoretical recombination event that might occur during mixed infection in vivo (Fig. 1B).

(B) , SARS-CoV Bat-SCoV. . Bat-SRBD Bat-SCoV, , RBD Bat-SCoV ( Bat-SCoV 323–505) RBD SARS-CoV ( 319–518) ( GenBank FJ211860 ). Bat-SRBD-MA RBD MA15 SARS-CoV Y436H. Bat-SRBM 13 SARS-CoV, ACE2, RBD 323I-429T Bat-SCoV 426R-518D SARS-CoV. Bat-Hinge Bat-SRBM, Bat-SCoV 392L-397E SARS-CoV 388V-393D. Bat-F 1–24057 SARS-CoV ( 855 ) 3'- Bat-SCoV. 1- (P1). ND , .
Quellentext
(B) Schematic representation showing organization of the SARS-CoV and Bat-SCoV Spike proteins. The engineered Spike proteins are pictured below with the virus name to the left. Bat-SRBD includes all of the Bat-SCoV Spike sequence except that the Bat-SCoV RBD (Bat-SCoV amino acid 323–505) is replaced with the SARS-CoV RBD (amino acid 319–518) (GenBank accession no. FJ211860). Bat-SRBD-MA includes the MA15 Spike RBD change at SARS-CoV aa Y436H. Bat-SRBM includes the minimal 13 SARS-CoV residues critical for ACE2 contact, resulting in a chimeric RBD of Bat-SCoV amino acid 323I-429T and SARS-CoV amino acid 426R-518D. Bat-Hinge is Bat-SRBM sequence, with Bat-SCoV amino acid 392L-397E replaced with SARS-CoV amino acid 388V-393D. Bat-F includes nt 1–24057 of SARS-CoV (to Spike amino acid 855), with the remaining 3? sequence from Bat-SCoV. To the right of the schematic representations, observation of transcript activity and approximate stock titers at passage 1 (P1) are indicated. ND indicates no infectious virus detected by plaque assay.

Barik 2016

In der Arbeit von Barik im Allgemeinen gibt es viele Remakes. Zum Beispiel im Jahr 2016, das Jahr , wiederholte er fast die gleiche Arbeit mit Shi Chzhenli bis zum Jahr 2015 einen chimären Virus zu schaffen, aber diesmal legte er in myshinoadaptirovanny SARS Stück spinous Protein nicht aus RsSCH014, und von einem anderen gefunden Shi Chzhenli in Yunnan es enger Verwandter - Rs3367. Um genau zu sein, aus Stamm WIV1, einem Laborklon von Rs3367, der 2013 in Zellkultur am Wuhan Institute of Virology gezüchtet wurde. Genau das hat Bariks Gruppe 2016 getan:

SARS-CoV (7), WIV1-CoV, , , , (. S1A). WIV1-CoV, SARS WIV1 (WIV1-MA15, . S1B). … Vero SARS-CoV Urbani, WIV1-MA15 WIV1-CoV.
Using the SARS-CoV infectious clone as a template (7), we designed and synthesized a full-length infectious clone of WIV1-CoV consisting of six plasmids that could be enzymatically cut, ligated together, and electroporated into cells to rescue replication competent progeny virions (Fig. S1A). In addition to the full-length clone, we also produced WIV1-CoV chimeric virus that replaced the SARS spike with the WIV1 spike within the mouse-adapted backbone (WIV1-MA15, Fig. S1B). … To confirm growth kinetics and replication, Vero cells were infected with SARS-CoV Urbani, WIV1-MA15, and WIV1-CoV.

Das heißt, im Großen und Ganzen hat Barik 2016 seinen Artikel aus dem Jahr 2015 geklont. Darüber hinaus ist mir seine Bedeutung nicht sehr klar: Immerhin stimmten WIV1 / Rs3367, wenn Sie sich erinnern, bereits zu 96% mit SARS-CoV überein (dafür wurde Shi Zhengli berühmt). Deshalb ist es mir nicht sehr klar, ein spike-ähnliches Protein von seinem nächsten Verwandten zurück in SARS-CoV einzufügen. Vielleicht nur aus Liebe zur Kunst. In diesem Licht erhält der Titel seines Artikels eine gewisse Dualität: „SARS-ähnliches WIV1-CoV ist bereit für den Übergang zum Menschen“ . Aus irgendeinem Grund fällt mir dieser Rahmen sofort ein:

Ich verstehe immer noch nicht, wie es Barik 2015 gelungen ist , ein Patent für die Herstellung von „chimären Coronavirus-Spike-ähnlichen Proteinen“ zu erhalten, wenn man bedenkt, dass er und Shi Zhengli dies alles lange vor 2015 veröffentlicht haben.

Barik 1990

Okay, der letzte Schliff für das Porträt von Ralph Barik. Er war nicht nur ein Oldtimer auf diesem Gebiet, sondern befasste sich bereits vor Sequenzierern und anderen modernen gentechnischen Werkzeugen mit der Entwicklung rekombinanter Coronaviren. Hier ist sein Artikel über die Entstehung von „Temperaturmutanten“ aus Maus-Coronavirus aus dem Jahr 1990:

Während dieser Studie wurde der Maus-Hepatitis-Virus-Stamm A59 (MHV-A59) verwendet. Das Virus wurde dreimal in einer kontinuierlichen Maus-Astrozytomzelllinie (DBT) vermehrt und kloniert.
...
Verschiedene Kombinationen von temperaturempfindlichen Mutanten wurden gemischt und in Zellen mit einer Infektionsmultiplizität von 10 geimpft.
Quellentext
The A59 strain of mouse hepatitis virus (MHV-A59) was used throughout the course of this study. Virus was propagated and cloned three times in the continuous murine astrocytoma cell line (DBT).
…
Various combinations of ts mutants were mixed and inoculated onto cells at a multiplicity of infection of 10 each.

So stellt Barik seit über 30 Jahren verschiedene virale Mutanten her.

Barik 2019

Übrigens verringert sich das Tempo auch jetzt noch nicht. Ende Oktober 2019 legte seine Gruppe einen weiteren Artikel zur wichtigen Rolle der Furinstelle im Spike-Protein zur Überwindung der „Barriere gegen zoonotische Infektionen“ durch Coronaviren zur Veröffentlichung vor :

Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass die Protease-Spaltung auch ein Haupthindernis für eine Vero-Zell-Infektion mit HKU5-CoV darstellt. Im weiteren Verlauf verglichen wir die vorhergesagte Spaltung an der S1 / S2-, S2'-Grenze und der endosomalen Cysteinprotease-Stelle in den MERS-, PDF2180- und HKU5-Spike-Proteinen (6D) (26). An der S1 / S2-Stelle behalten MERS, Uganda und HKU5 die RXXR-Spaltstelle bei, obwohl verschiedene interne Aminosäuren ihre Wirksamkeit beeinträchtigen können. Für die S2'-Sequenz behalten MERS und HKU5 auch das RXXR-Motiv bei; Das erste Arginin (SNAR) fehlt jedoch in den Spitzen des Uganda-Stammes, was möglicherweise seine Spaltung beeinflusst.
Quellentext
Together, these results demonstrate that protease cleavage is also the primary barrier to infection of Vero cells with HKU5-CoV. Examining further, we compared the predicted cleavage at S1/S2 border, S2’, and the endosomal cysteine protease site across MERS, PDF2180, and HKU5 spikes (Fig. 6D) (26). For the S1/S2 site, MERS, Uganda, and HKU5 maintain the RXXR cleavage motif, although the different interior amino acids may alter efficiency. For the S2’ sequence, MERS and HKU5 also retain the RXXR motif; however, the Uganda spike lacks the first arginine (SNAR), potentially impacting cleavage.

Angesichts des Wettbewerbsgeistes zwischen den Gruppen Barik und Shi Zhengli frage ich mich, wie wahrscheinlich es ist, dass Ende 2019 in Wuhan auch jemand ähnliche Untersuchungen durchgeführt hat.

Funktionsgewinn: "Verweigern kann nicht fortgesetzt werden"

Viele, die zuerst von den oben genannten Studien hören, stellen eine vernünftige Frage: "Was zur Hölle?" Warum erzeugen Wissenschaftler chimäre Killerviren? Politisch korrekte Antwort: Entwicklung eines vorbeugenden Schutzes (Impfstoffe und Medikamente) vor möglichen natürlichen Chimären und Verständnis der Risiken ihres Auftretens. In der Tat, dass Barik und Shi Zhengli und Co-Autoren selbst zu diesem Thema im selben Artikel von 2015 geschrieben haben:

, (GOF). (Fig. 4a, b) , SHC014-MA15, , . SHC014-MA15 SARS-CoV, , CoV Urbani MA15, , . , Urbani-MA15 CoV, SHC014-MA15 (. 1). , , , . , . GOF; . , , , .
Quellentext
In addition to offering preparation against future emerging viruses, this approach must be considered in the context of the US government–mandated pause on gain-of-function (GOF) studies. On the basis of previous models of emergence (Fig. 4a,b), the creation of chimeric viruses such as SHC014-MA15 was not expected to increase pathogenicity. Although SHC014-MA15 is attenuated relative to its parental mouse-adapted SARS-CoV, similar studies examining the pathogenicity of CoVs with the wild-type Urbani spike within the MA15 backbone showed no weight loss in mice and reduced viral replication. Thus, relative to the Urbani spike–MA15 CoV, SHC014-MA15 shows a gain in pathogenesis (Fig. 1). On the basis of these findings, scientific review panels may deem similar studies building chimeric viruses based on circulating strains too risky to pursue, as increased pathogenicity in mammalian models cannot be excluded. Coupled with restrictions on mouse-adapted strains and the development of monoclonal antibodies using escape mutants, research into CoV emergence and therapeutic efficacy may be severely limited moving forward. Together, these data and restrictions represent a crossroads of GOF research concerns; the potential to prepare for and mitigate future outbreaks must be weighed against the risk of creating more dangerous pathogens. In developing policies moving forward, it is important to consider the value of the data generated by these studies and whether these types of chimeric virus studies warrant further investigation versus the inherent risks involved.

Waren diese Worte prophetisch? Ende 2014 haben die Vereinigten Staaten ein Moratorium für die staatliche Finanzierung solcher Funktionsgewinnstudien eingeführt, das jedoch fast sofort (2017) aufgehoben wurde . Und in China wurde kein Moratorium für solche Studien eingeführt, und im Gegenteil, sie eröffneten neue „super (ohne) gefährliche Labors“ auf BSL-4-Niveau, wie 2017 in Wuhan :

Für alle Fälle erkläre ich, dass das Labor am Wuhan Institute of Virology bis 2017 BSL-3 war, was ausreichte, um mit Coronaviren zu arbeiten. Hier einige Zitate aus dem obigen Hinweis zur Einrichtung des Wuhan BSL-4-Labors:

— , , BSL-4, . ; , . « ».
…
. BSL-4 ; , , , .

, , BSL-4 — , , — . « , , », — .

BSL-4 . , , , , . , , .

« », — . , : « , , ».

Laut Trevan kann Chinas Investition in das BSL-4-Labor vor allem ein Beweis dafür sein, dass das Land wettbewerbsfähig ist. "Dies ist ein großes Statussymbol in der Biologie", sagt er, "unabhängig davon, ob sie benötigt werden oder nicht."
Quellentext
Future plans include studying the pathogen that causes SARS, which also doesn’t require a BSL-4 lab, before moving on to Ebola and the West African Lassa virus, which do. Some one million Chinese people work in Africa; the country needs to be ready for any eventuality, says Yuan. “Viruses don’t know borders.”
…
The plan to expand into a network heightens such concerns. One BSL-4 lab in Harbin is already awaiting accreditation; the next two are expected to be in Beijing and Kunming, the latter focused on using monkey models to study disease.
Lina says that China’s size justifies this scale, and that the opportunity to combine BSL-4 research with an abundance of research monkeys — Chinese researchers face less red tape than those in the West when it comes to research on primates — could be powerful. “If you want to test vaccines or antivirals, you need a non-human primate model,” says Lina.
But Ebright is not convinced of the need for more than one BSL-4 lab in mainland China. He suspects that the expansion there is a reaction to the networks in the United States and Europe, which he says are also unwarranted. He adds that governments will assume that such excess capacity is for the potential development of bioweapons.
“These facilities are inherently dual use,” he says. The prospect of ramping up opportunities to inject monkeys with pathogens also worries, rather than excites, him: “They can run, they can scratch, they can bite.”
Trevan says China’s investment in a BSL-4 lab may, above all, be a way to prove to the world that the nation is competitive. “It is a big status symbol in biology,” he says, “whether it’s a need or not.”

Interessanterweise planten sie zusätzlich zu Wuhan die Eröffnung eines neuen BSL-4-Labors in Kunming, um Impfstoffe an Primaten zu testen. Kunming, ich erinnere Sie, dies ist die Hauptstadt von Yunnan. In den nahe gelegenen Höhlen fand Shi Zhengli genau die Stämme Rs3367 und RsSHC014. Übrigens wurden Primat-Tests als mögliche weitere Schritte für die Entwicklung von vorbeugenden Impfstoffen gegen mögliche zukünftige Ausbrüche von Coronaviren in dem gleichen Artikel (wie oft habe ich das so genannt?) Erwähnt. Artikel von Barik und Shi Zhengli:

Es sind jedoch weitere Tests an nichtmenschlichen Primaten erforderlich, um diese Ergebnisse in ein pathogenes Potenzial beim Menschen umzusetzen. Es ist wichtig anzumerken, dass der Mangel an verfügbaren Therapeutika den kritischen Bedarf für weitere Studien und die Entwicklung von Behandlungsmethoden bestimmt. Mit diesem Wissen können Überwachungsprogramme, diagnostische Reagenzien und wirksame Behandlungen entwickelt werden, die vor dem Auftreten von Coronaviren der Gruppe 2b wie SHC014 schützen und auf andere Coronavirus-Zweige angewendet werden können, die ähnliche heterogene Pools unterstützen.
Quellentext
However, further testing in nonhuman primates is required to translate these finding into pathogenic potential in humans. Importantly, the failure of available therapeutics defines a critical need for further study and for the development of treatments. With this knowledge, surveillance programs, diagnostic reagents and effective treatments can be produced that are protective against the emergence of group 2b–specific CoVs, such as SHC014, and these can be applied to other CoV branches that maintain similarly heterogeneous pools.

Es ist möglich, dass bis 2019 die Entwicklung und Erprobung potenzieller Impfstoffe aus verschiedenen SARS-ähnlichen Coronaviren bereits in vollem Gange war.

Über wie viele wundersame Epidemien bereitet der Geist der Erleuchtung ...

Dann schauen wir uns die Laborleck-Version an. Zunächst werde ich einen kurzen historischen Hintergrund zu anderen Lecks geben. Weil in der Vergangenheit mehr als einmal Viren aus Labors geschossen wurden. Zuallererst von derselben SARS-CoV: Zum ersten Mal floh er im Sommer 2003 nach Singapur, dann im Dezember 2003 nach Taiwan und flog im Frühjahr 2004 zweimal nach Peking.

Es gab alarmierende Anrufe in Europa und den USA, obwohl es dort keine Infektionen gab. In Frankreich beispielsweise hat ein Labor Reagenzgläser mit SARS verloren , und in den USA, BSL-4-Labor in Texas, fehlten Reagenzgläser mit dem venezolanischen Hämorrhagischen Fiebervirus:

Nur ein Wissenschaftler arbeitete mit dem Virus, und Reyes sagte, das Labor habe den Verdacht, dass der Wissenschaftler im November versehentlich ein Reagenzglas geworfen habe.
...
Das Galveston Biolaboratorium hat die strengsten Sicherheitsmaßnahmen, da es BSL-4-Biosicherheitsmaterialien untersucht, dh gefährliche Infektionskrankheiten, die keine Impfstoffe oder Medikamente enthalten. BSL-4-Materialien umfassen Guanarito, Ebola und Pocken.
Quellentext
Only one scientist worked with the virus, and Reyes said the lab suspects that scientist accidentally threw the vial away in November.
…
Galveston biolab requires the most stringent safety measures because it studies biosafetly level BSL-4 materials, or dangerous infectious diseases that have no vaccines or cures. BSL-4 materials include Guanarito, Ebola and smallpox.

Die Geschichte kennt andere, viel größere Lecks . Zum Beispiel die "Auferstehung" des H1N1-Grippevirus im Jahr 1977, die zuvor als verschwunden galt. Ja, das ist das Virus derselben "Spanierin":

H1N1 1918 , ( 1947 ), 1957 «» H2N2, . H1N1, -, , 20 . 1969 H3N2 H2N2 .

1977 . H1N1 , 1978 . , 1977 . H1N1 - , , . , , , H1N1 1977 H1N1, 1949–1950 , , .
…
2009–2010 . , H1N1 1977 : « — A H1N1, 1977 ».
…
, 1977 . H1N1, , « » (Kung 1978). , , , 1970- ( ) . .

, , 1977–78 . - , , -, H1N1 1978 . H1N1, , . 1976–77 20 H1N1 1957, . 1977 , .
Human influenza H1N1 viruses appeared with the 1918 pandemic, and persisted, slowing accumulating small changes in its genome (with a major change in 1947), until the H2N2 “Asian” flu appeared in 1957, causing a worldwide pandemic. H1N1 influenza virus then apparently became extinct, and was not isolated for 20 years. In 1969 the “Hong Kong” H3N2 virus replaced the H2N2 virus, and is still circulating.
In September 1977 an H1N1 influenza virus was isolated from human infections in the Far East region of the Soviet Union, and in early 1978 the Chinese reported they had isolated H1N1 virus in May of 1977 in northeast China adjacent to the Soviet outbreak. Using the early genetic tools available at the time, the 1977 H1N1 virus was found to be closely related to H1N1 human influenza viruses circulating in 1949–1950, but not to those circulating earlier or later.
…
Only since 2009–2010 did major papers begin to state directly the 1977 emergence of H1N1 influenza was a laboratory related release: “The most famous case of a released laboratory strain is the re-emergent H1N1 influenza A virus which was first observed in China in May of 1977 and in Russia shortly thereafter.”
…
The speculation that the 1977 release may have been related to H1N1 vaccine research is supported by the observation that in the initial outbreaks in China, nine of the ten viral isolates expressed “temperature sensitivity” (Kung 1978). Temperature sensitivity normally an uncommon trait, but one that was in the 1970s (and still is) a fundamental trait for making live attenuated influenza vaccines. Temperature sensitivity generally occurs only after a series of substantial laboratory manipulations and selections.
Interestingly, further investigation indicated the circulating strains in 1977–78 were often comprised of mixed temperature-sensitive and normal components, and that temperature sensitivity apparently disappeared from the post-1978 H1N1 lineage rapidly. Escape of a mid-protocol population of H1N1 virus undergoing laboratory selection for temperature sensitive mutants would provide such a mixed population. In 1976–77 laboratory personnel in their late teens or early 20s would not have been exposed to pre-1957 H1N1 influenza viruses, and been susceptible to laboratory infections. The low severity of the 1977 pandemic might be in part due to the temperature sensitivity of the virus, a trait that limits virus replication in pulmonary tissues.

Es scheint, dass die Schaffung temperaturempfindlicher Virusmutanten zur Entwicklung potenzieller „abgeschwächter“ Impfstoffe am Ende des 20. Jahrhunderts weit verbreitet war. Wenn Sie sich erinnern, experimentierte Barik 1990 auch mit der Erzeugung temperaturempfindlicher Stämme.

Könnte so etwas die Coronavirus-Pandemie von 2019 verursachen? Warum nicht? Hier sind mehrere Optionen möglich - von der Entwicklung eines potenziellen Impfstoffs bis hin zur Erforschung der Laborrekombination der Fledermaus- und Pangolin-Viren. Einige besonders ehrgeizige Forscher könnten sich sogar einfach für eine Eigeninitiative entscheiden, um die beiden „Modethemen“ zu kombinieren - Hinzufügen einer Furinstelle und Transplantation von RBM von einem Stamm einer Art (Pangolin) zu einem anderen (Fledermäuse), um später die erhöhte Virulenz des neuen chimären Designs zu bestätigen. einen weiteren beeindruckenden Artikel über die Gefahr zu veröffentlichen, die die Menschheit in Yunnan-Höhlen oder auf feuchten Märkten erwartet. Und wenn ein Impfstoff gegen solch einen gefährlichen Stamm präventiv hätte hergestellt werden können, wäre Ehre und Respekt für einen solchen Forscher garantiert gewesen.

Bestätige ich, dass es so war? Natürlich nicht. Denn heute gibt es keine Hinweise auf ein solches Szenario. Es gibt nur eine Reihe seltsamer Zufälle - zum Beispiel, dass der Ausbruch des Yunnan-Coronavirus Tausende von Kilometern von Yunnan entfernt genau auf dem Markt stattfand, der dem Wuhan-Institut für Virologie am nächsten liegt. Oder vielleicht nicht auf dem Markt, wegen der ersten 4 kranken Patienten waren drei nicht auf dem Markt . Nun, das Zusammentreffen der strukturellen Merkmale des Genoms des Virus, die den Manipulationen ähneln, die Virologen wiederholt mit solchen Viren im Labor durchgeführt haben. Aber Zufälle sind kein Beweis.

Darüber hinaus treten Zufälle auf, und natürlich könnte eine solche Belastung auch in der Natur aufgetreten sein. Es ist noch nicht klar, wie genau - dafür sollten sich die Fledermaus- und Pangoliniumstämme in einer Zelle (der Zelle eines Körpers, nicht in der Metallzelle) und in Wuhan treffen, da der Ausbruch dort stattfand (sonst hätten wir andere Herde von Covid gesehen) der Weg des ersten Viehs nach Wuhan). Angesichts der Tatsache, dass Fledermäuse nicht auf dem Wuhan-Markt verkauft wurden und zu dieser Jahreszeit im Allgemeinen im Winterschlaf waren, ist diese Option immer noch ein ungelöstes Rätsel.

Übrigens gab es kürzlich Neuigkeiten, dass amerikanische Experten 2018 eine Inspektion des Wuhan-Instituts durch Virologen durchführten und sogar mit Shi Zhengli sprachen. Das Ergebnis ihrer "Tour" waren zwei diplomatische Telegramme nach Washington, in denen sie eine Reihe von Schwachstellen bei der Gewährleistung der Sicherheit des Labors feststellten:

Telegrammquellen sagten, sie hätten den Alarm wegen schwerwiegender Sicherheitsprobleme im WIV-Labor auslösen sollen, insbesondere hinsichtlich der Arbeit mit Fledermaus-Coronaviren. Vertreter der Botschaft forderten die Vereinigten Staaten auf, diesem Labor mehr Aufmerksamkeit zu schenken und zusätzliche Unterstützung zu leisten.
...
« WIV , , », — 19 2018 , , , WIV. ( .)
Chinesische WIV-Forscher erhielten Hilfe vom Galveston National Laboratory der medizinischen Abteilung der University of Texas und anderen Organisationen in den USA, aber die Chinesen suchten zusätzliche Hilfe. Telegramme argumentieren, dass die Vereinigten Staaten das Wuhan-Labor weiter unterstützen sollten, hauptsächlich weil ihre Untersuchung von Fledermaus-Coronaviren wichtig, aber auch gefährlich war.
Quellentext
Sources familiar with the cables said they were meant to sound an alarm about the grave safety concerns at the WIV lab, especially regarding its work with bat coronaviruses. The embassy officials were calling for more U.S. attention to this lab and more support for it, to help it fix its problems.
…
“During interactions with scientists at the WIV laboratory, they noted the new lab has a serious shortage of appropriately trained technicians and investigators needed to safely operate this high-containment laboratory,” states the Jan. 19, 2018, cable, which was drafted by two officials from the embassy’s environment, science and health sections who met with the WIV scientists. (The State Department declined to comment on this and other details of the story.)
The Chinese researchers at WIV were receiving assistance from the Galveston National Laboratory at the University of Texas Medical Branch and other U.S. organizations, but the Chinese requested additional help. The cables argued that the United States should give the Wuhan lab further support, mainly because its research on bat coronaviruses was important but also dangerous.

Es ist lustig, dass das texanische Labor in Galveston, das einst selbst ein Reagenzglas mit dem venezolanischen Virus verloren hatte , den Wuhanern half . Darüber hinaus half sie nicht nur in Worten, Wuhan-Spezialisten nahmen dort an Schulungen teil, die sogar vom Wuhan Bulletin verfasst wurden (obwohl die Veröffentlichung jetzt von der Website gelöscht wurde, aber immer noch im Webarchiv verfügbar ist ):

Der letzte Schliff für das Familienporträt von Laborlecks: Im November 2019 kam es in zwei Forschungszentren in Lanzhou zu einem Ausbruch der Brucellose (einer bakteriellen Infektion), von der mehr als 100 Forscher betroffen waren.

Mögliche Spuren von Menschen gemacht

Dann lassen Sie die Virologen in Ruhe und wenden Sie unsere Augen wieder dem Virus selbst zu. Gibt es irgendwelche offensichtlichen Anzeichen von Menschlichkeit? Zunächst ein paar Worte darüber, was „explizit“ bedeutet. Es ist klar, dass Mutationen in der Natur völlig zufällig auftreten können. Selbst wenn die Verknüpfung, die die Furin-Site in CoV2 erstellt hat, nicht "PRRA", sondern "MADEINWVHANPRRA" wäre, würde es immer noch eine Chance ungleich Null geben, dass sie zufällig entstehen könnte. Aber für uns und für jedes Gericht würde dies ausreichen, um die vom Menschen geschaffene Herkunft zweifelsfrei zu beweisen .

Das Hauptproblem bei solchen Beweisen ist, dass sie selbst in einem vom Menschen verursachten Virus einfach nicht existieren können. Grob gesagt kann ein guter Gentechniker ein synthetisches Virus erzeugen, das "mit dem natürlichen identisch" ist. Darüber hinaus führen Forscher häufig absichtlich auch Mutationen in ihre Strukturen ein, damit ihr Stamm und der natürliche später unterschieden werden können. Wenn der Schöpfer des Virus diese Marker der Menschlichkeit jedoch nicht offenbart, ist es unmöglich, sie von natürlichen Mutationen zu unterscheiden.

Aber manchmal können Spuren zurückbleiben, besonders wenn die Schöpfer nicht versuchen, die Männlichkeit ihres Designs zu verbergen. Zunächst sprechen wir über die Stellen von DNA-Schnitten (ich erinnere mich, dass Manipulationen mit RNA-Viren genau in ihren DNA-Konstrukten durchgeführt werden), notwendig, damit die Schöpfer verschiedene Segmente des Genoms zusammennähen oder alte herausschneiden und neue Stellen einfügen können. In der Tat kann DNA nicht an beliebigen Stellen geschnitten werden (Crisper zählt nicht), sondern nur dort, wo die Sequenz der Nukleotide (normalerweise 4-6 "Buchstaben") mit der Sequenz übereinstimmt, die von dem einen oder anderen Restriktionsenzym erkannt wird, dh einem Enzym, das die Nukleotidketten abbaut . Darüber hinaus erschwert eine solche Analyse die Tatsache, dass in der Gentechnik Hunderte verschiedener Arten von Restriktionsenzymen verwendet werden. Aber versuchen wir, eine solche Analyse für CoV2 durchzuführen.

Zunächst ein Beispiel für die Arbeit der Barik-Gruppe aus dem Jahr 2008, bei der sie Bat-SCoV einnahmen und RBD in seinem Spike-Protein durch RBD aus menschlichem SARS ersetzten. So beschreiben sie die Entstehung ihrer Chimäre:

SARS-CoV Bat-SCoV.
(A) SARS-CoV Bat-SCoV ( GenBank FJ211859) . () nsp ORF1ab ( , - ; , nsp5 [3C- ]). , , A F. , Bat-SCoV, SARS-CoV, , Bat-SCoV 2 , Bat-E1 Bat-E2, SARS-E.
Schematic representation of SARS-CoV and Bat-SCoV variants.
(A) Schematic representation of SARS-CoV and Bat-SCoV (GenBank accession no. FJ211859) genomes and reverse genetics system. (Top) Arrowheads indicate nsp processing sites within the ORF1ab polyprotein (open arrowheads, papain-like proteinase mediated; filled arrowheads, nsp5 [3C-like proteinase] mediated). Immediately below are the fragments used in the reverse genetics system, labeled A through F. The fragments synthesized to generate Bat-SCoV exactly recapitulate the fragment junctions of SARS-CoV with the exception that the Bat-SCoV has 2 fragments, Bat-E1 and Bat-E2, which correspond to the SARS-E fragment.

Wie Sie sehen können, hat die Barik-Gruppe zuerst einen synthetischen Klon der Fledermaus Bat-SCoV erstellt und darüber hinaus gemäß den zuvor erstellten „Mustern“ des synthetischen Klons SARS-CoV. Das heißt, für den Fledermausklon verwendeten sie dieselben 6 Segmente mit denselben Restriktionsenzymstellen, die sie zuvor für SARS-CoV verwendet hatten, wodurch sie Virensegmente zwischen verschiedenen Stämmen wie Legostücken austauschen konnten. Hier ist eine detaillierte Beschreibung der Erzeugung einer chimären Mutante:

, - , SARS-CoV (24, 33, 53) . , Bat-F A-E SARS-CoV F Bat-SCoV, Bgl-NotI. Bat-SCoV Bat-SRBD, Bat-SRBM Bat-Hinge , 7 Bat-SCoV, BglI Bat-A, Bat-B, Bat-C Bat -D, BglI AflII Bat-E1 Bat-E2 BglI NotI Bat-F. , . m7Message mMachine (Ambion), Vero (24, 53).
Viruses containing PCR-generated insertions within the viral coding sequence were produced by using the SARS-CoV assembly strategy (24, 33, 53) with the following modifications. Briefly, for Bat-F virus, full-length cDNA was constructed by ligating restriction products from SARS-CoV fragments A–E and Bat-SCoV fragment F, which required a BglI-NotI digestion. For Bat-SCoV and Bat-SRBD, Bat-SRBM, and Bat-Hinge, plasmids containing the 7 cDNA fragments of the Bat-SCoV genome were digested by using BglI for Bat-A, Bat-B, Bat-C, and Bat-D, BglI and AflII for Bat-E1 and Bat-E2, and BglI and NotI for Bat-F. Digested, gel-purified fragments were simultaneously ligated together. Transcription was driven by using a T7 mMessage mMachine kit (Ambion), and RNA was electroporated into Vero cells (24, 53).

Alle diese aus drei Buchstaben bestehenden Abkürzungen (BglI, AflII, NotI usw.) im oben hervorgehobenen Satz sind verschiedene Arten von Restriktionsenzymen. Mal sehen, ob es Unterschiede in den Restriktionsenzymstellen im Genom (Spike-Protein) der Chimäre im Vergleich zum Genom des ursprünglichen SARS-CoV gibt:

Wie zu sehen ist, sind die Restriktionsenzymstellen der Chimäre fast identisch mit den Stücken der ursprünglichen Sequenzen in Bat-SCoV oder SARS, von denen sie entnommen wurden. Die einzigen Unterschiede sind an den Vernetzungsstellen des eingefügten SARS-Stücks sichtbar. Hier zum Beispiel die linke (5'-) Kante des Einsatzes:

Hier stellte sich heraus, dass Bat-SCoV und SARS eine gemeinsame identische Nucleotidregion aufweisen (der Schnittpunkt der türkisfarbenen und rosa Regionen), und es gibt keine neuen Restriktionsenzymstellen an der Stelle der beiden Sequenzen, die zusammenfügen, im Gegensatz dazu verschwand die SspI-Stelle von SARS. Und hier ist die rechte (3'-) Kante des Einsatzes:

Im Gegensatz dazu blieben hier alle alten Restriktionsenzymstellen an der Bindungsstelle, und sogar neue erschienen, zum Beispiel EcoR II. Wenn ich nicht wüsste, dass das chimäre Genom das Ergebnis künstlicher Manipulationen ist, könnte ich dies anhand dieser drei Sequenzen verstehen? Es ist unwahrscheinlich, dass selbst wenn sich einige Verdächtigungen eingeschlichen hätten, dies sicherlich nicht zweifelsfrei war . Vielleicht hätten Spezialisten der Gentechnik dies für einige andere Anzeichen gesehen, kann ich nicht sagen - ich freue mich über jedes Bildungsprogramm hier.

Vergleichen wir auf jeden Fall das Spike-Protein in RaTG13, CoV2 und Pangolin-19. Plötzlich wird etwas auf uns springen, wenn es herausspringt!

So sehen RBD (hellgrün hervorgehoben) und RBM (gelb) für alle drei aus:

Was ist so interessant? Es war interessant, die EcoR I- Site am 5'-Rand von RBM für alle drei (die erste Verbindung zwischen dem grünen und dem gelben Bereich) zu sehen - sehr praktisch. Ich frage mich, wie häufig diese Funktion bei anderen Sorten auftritt. Eine flüchtige Analyse ergab, dass unsere Dreifaltigkeit bei der Anzahl solcher Stellen im Genom Meister ist, bei anderen Fledermausstämmen gibt es nur 5 davon:

Zurück zur Analyse der RBD können anhand der Merkmale von CoV2 neue Restriktionsenzymstellen festgestellt werden, die in roten Rechtecken hervorgehoben sind - sie fallen mit eindeutigen Mutationen in der Aminosäuresequenz zusammen (auch mit roten Rechtecken auf Aminosäuresequenzen in der rechten Spalte markiert). Für alle Fälle habe ich einige weitere neue Stellen hervorgehoben: blaue Rechtecke und ein grünes Rechteck, das sich im Bereich der einzigen Aminosäure befindet, die sich zwischen RBM CoV2 und Pangolin-19 unterscheidet.

Vergleichen wir in allen drei Stämmen die Stelle des PRRA-Inserts, das die Furinstelle in CoV2 erzeugt hat:

Auch hier erschienen auf beiden Seiten der neuen Beilage mehrere neue Stellen (blau hervorgehoben). Könnten sie verwendet werden, um eine Furin-Site zu erstellen? Theoretisch ja. Das Einfügen kann jedoch unter Verwendung vorhandener Sites oder sogar durch Erstellen von Segmenten mit neuen Sites erfolgen, die dann nahtlos kombiniert werden, dh ohne neue Sites an der Kreuzung zu erstellen. Wenn Sie sich erinnern, hat Barik diese Technologie bereits 2002 angewendet , um einen synthetischen Klon des Maus-Coronavirus zu erstellen:

Die Verbindungsstellen der Restriktionsstellen, die sich an den Enden jeder cDNA befinden, werden systematisch während des Zusammenbaus des vollständigen cDNA-Produkts voller Größe entfernt, was einen Zusammenbau ohne Modifikation der Nukleotide ermöglicht.
Quellentext
The interconnecting restriction site junctions that are located at the ends of each cDNA are systematically removed during the assembly of the complete full-length cDNA product, allowing reassembly without the introduction of nucleotide changes.

Und 2003 wiederholte er auf dem synthetischen Klon SARS-CoV:

Um Konsensusklone schnell zusammenzusetzen, verwendeten wir Restriktionsendonukleasen der Klasse IIS, die in asymmetrische Regionen geschnitten werden und asymmetrische Enden hinterlassen. Diese Enzyme erzeugen spezifische einzigartige Überhänge, die eine nahtlose Ligation von zwei cDNAs mit anschließendem Verlust der Restriktionsstelle ermöglichen .
Quellentext
To rapidly assemble consensus clones, we used class IIS restriction endonucleases that cut at asymmetric sites and leave asymmetric ends. These enzymes generate strand-specific unique overhangs that allow the seamless ligation of two cDNAs with the concomitant loss of the restriction site.

Die Technologie des Jonglierens mit Gensequenzen ist bereits heute so automatisiert und in Betrieb genommen, dass es in einem chinesischen Artikel vom Oktober 2019 über die Insertion einer neuen Furinstelle in das Hühner-Coronavirus nur einige Vorschläge für deren Beschreibung gibt:

2.2. Erzeugung eines rekombinanten Virus Das
rekombinante Virus rYN-S2 / RRKR, das ein Spike-Protein mit einer Furinstelle S2 'enthält, wurde durch Vaccinia-Rekombination erhalten, wie zuvor beschrieben [20, 28]. Kurz gesagt wurde ein S'-Furinstellenplasmid unter Verwendung des Seamless Assembly-Kits (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) erzeugt und in CV-1-Zellen transfiziert, die mit Vaccinia-Virus infiziert waren, das das YN- & Dgr; S-GPT-Gen enthielt. Die Furin-S2-Stelle wurde durch homologe Rekombination unter Verwendung eines zeitlich dominanten Selektionssystems in die YN-cDNA eingeführt [25].
Quellentext
2.2. Generation of Recombinant Virus
Recombinant rYN-S2/RRKR virus containing an S protein with the furin-S2? site was generated by vaccinia recombination, as described previously [20,28]. Briefly, plasmid with the furin-S2? site was generated using the Seamless Assembly kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) and transfected into CV-1 cells infected by vaccinia virus containing the genome of YN-?S-GPT. Furin-S2’ site was introduced into the YN cDNA by homologous recombination using the transient dominant selection system [25].

Es ist unmöglich, nicht zu bewundern, zu welchen Fortschritten es gekommen ist! Hier ist eine Beschreibung des obigen Seamless Assembly-Kits :

GeneArt 1 4 , , 30- . E.coli .
• — 4 ( 13 ); ,
• — , , , 90% .
• —
• — - -,
• — , , .
The GeneArt Seamless Cloning and Assembly Kit enables the simultaneous and directional cloning of 1 to 4 PCR fragments, consisting of any sequence, into any linearized vector, in a single 30-minute room temperature reaction. The kit contains everything required for the assembly of DNA fragments, and their transformation into E. coli for selection and growth of recombinant vectors.
• Speed and Ease?—?Clone up to 4 DNA fragments, with sequence of your choice, simultaneously in a single vector (up to 13 Kb); no restriction digestion, ligation or recombination sites required
• Precision and Efficiency — Designed to let you clone what you want, where you want, in the orientation you want, and achieve up to 90% correct clones with no extra sequences left behind
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Bis zu 4 DNA-Fragmente können in nur einer halben Stunde in der gewünschten Sequenz geklebt werden, ohne Kopfschmerzen mit Restriktionsenzymen oder Ligation. Laden Sie Ihre Kreation auf E. coli hoch , um das resultierende Design zu verbreiten.

Zusammenfassend muss die Analyse der Restriktionsenzymstellen zusammengefasst werden, und es muss anerkannt werden, dass aus ihren Ergebnissen keine eindeutigen Schlussfolgerungen gezogen werden können. Es sei denn, es konnte erneut sichergestellt werden, dass nicht nur CoV2 einzigartig ist, sondern dass RaTG13 selbst ein sehr ungewöhnlicher Kamerad ist und dass es sich lohnt, seine Biografie weiter zu studieren.

Codon-Einstellungen

Zu diesem Zweck habe ich mich auch mit Codon Usage Bias befasst , um herauszufinden, welche Stämme anderer Viren wie CoV2 und RaTG13 aussehen. Es ist kein Geheimnis, dass Viren dazu neigen, sich in ihrer Codonsignatur an die Vorlieben ihrer Wirte anzupassen , daher erwartete ich ein ähnliches Muster mit anderen Hepatomirus-Viren in RaTG13 und hoffte auch, einen Unterschied zu Pangolin-Stämmen zu sehen.

Hier ist SARS-CoV zum Beispiel Rs3367 und RsSCH014 sehr ähnlich, wie Sie vielleicht erwarten:

SARS, MERS und CoV2 unterscheiden sich übrigens untereinander:

RaTG13 ähnelt CoV2, was auch zu erwarten ist:

Aber RaTG13 ist den Pangolin-Stämmen wirklich nicht sehr ähnlich, und die Pangolin-Stämme sind nicht genau identisch miteinander:

Auf dem ZXC21 und ZC45 ist auch nicht sehr ähnlich:

Von den Yunnan-Stämmen ist RaTG13 von Rs3367 und RsSCH014 ziemlich weit und LYRa11 am nächsten, aber auch mit merklichen Unterschieden:

Im Allgemeinen sind RaTG13 und CoV2 wie immer irgendwie getrennt. Ich war auch fasziniert vom AAA-Codon - sie verwenden es viel häufiger als ihre Stammesgenossen:

Dies ist wahrscheinlich nur ein weiterer Zufall, aber ein ähnliches Verhältnis zwischen AAA und AAG wird beobachtet , in E. coli . Kann sich die cDNA-Signatur von cDNA ändern, wenn sie für eine lange Zeit in der Zellkultur kultiviert wird? Theoretisch ja, aber ich habe dieses Thema noch nicht eingehend untersucht.

Nun, die Codonanalyse ergab auch keine offensichtlichen Anzeichen von Kreativität, bestätigte jedoch erneut die Einzigartigkeit von CoV2 und RaTG13. Was haben wir in trockenem Zustand? Bisher gibt es nur eine Reihe seltsamer Zufälle, die, wie Wissenschaftler gerne sagen, zusammengenommen , dh insgesamt zum Nachdenken anregen. Und sicherlich erlaubt es nicht, die Hypothese über die künstliche Natur von CoV2 abzulehnen.

Aber was ist mit der Widerlegung der Menschlichkeit in der Natur?

Wie erlaubt nicht? Und warum erlaubt der Autor dieses Artikels in Nature? Tatsächlich gibt es in diesem Artikel keine Widerlegung der Menschlichkeit. Es gibt nur ein lautes "Wir glauben nicht", das auf einer sehr instabilen Grundlage basiert. Überzeugen Sie sich selbst - dies sind die Hauptpunkte der Autoren zur Unterstützung des Wunders:

, SARS-CoV-2 ACE2 , , , RBD SARS-CoV [ SARS — ..] . , SARS-CoV-2 ACE2, , ACE2, . , SARS-CoV-2 .
While the analyses above suggest that SARS-CoV-2 may bind human ACE2 with high affinity, computational analyses predict that the interaction is not ideal and that the RBD sequence is different from those shown in SARS-CoV to be optimal for receptor binding. Thus, the high-affinity binding of the SARS-CoV-2 spike protein to human ACE2 is most likely the result of natural selection on a human or human-like ACE2 that permits another optimal binding solution to arise. This is strong evidence that SARS-CoV-2 is not the product of purposeful manipulation.

Dieses Zitat im Artikel ist direkt unter dem Diagramm gezeigt, das die identischen RBMs von CoV2 und Pangolin-19 zeigt. Warten Sie, was hat "Computersimulation" damit zu tun? Das wahrscheinlichste vom Menschen verursachte Szenario ist die Übertragung von RBM von einem Stamm eines Tieres auf einen Stamm eines anderen Tieres - was Virologen bereits wiederholt durchgeführt haben. Daher hält die logische Kette der Autoren der Kritik nicht stand: „Auf einem Computer konnte ein steilerer Virus entwickelt werden, daher ist CoV2 das Ergebnis natürlicher Selektion. Oh, das ist ein starker Beweis dafür, dass CoV2 nicht von Hand hergestellt wird! “ Anscheinend haben die Autoren eine schlechte Logik. Ihre weiteren Thesen bestätigen dies:

, , , , -. , , SARS-CoV-2 - .
Furthermore, if genetic manipulation had been performed, one of the several reverse-genetic systems available for betacoronaviruses would probably have been used. However, the genetic data irrefutably show that SARS-CoV-2 is not derived from any previously used virus backbone.

Wieder der gleiche logische Fehler, der durch laute Wendungen verschleiert wird: "Die genetische Analyse beweist unwiderlegbar, dass CoV2 definitiv nicht auf der Basis zuvor bekannter Viren erzeugt wurde!" Vielen Dank, Captain Evidence. Und was konnten die Schöpfer des Virus wirklich nicht aus einem zuvor unveröffentlichten Stamm des Virus - zum Beispiel aus demselben RaTG13 - ein cDNA-Rückgrat bilden? Ja einfach. Es wäre für sie auch nicht schwierig, das RBM-Pangolinium und die Furinstelle dort einzufügen. Virologen tun dies seit 20 Jahren, und moderne gentechnische Instrumente machen solche Manipulationen sogar für Studenten zugänglich.

Bezüglich des Ursprungs der Furinstelle in der Zellkultur äußern die Autoren auch seltsame Thesen:

, O- . in vitro in vivo. , SARS-CoV-2 - , . ACE2, , .
The acquisition of both the polybasic cleavage site and predicted O-linked glycans also argues against culture-based scenarios. New polybasic cleavage sites have been observed only after prolonged passage of low-pathogenicity avian influenza virus in vitro or in vivo. Furthermore, a hypothetical generation of SARS-CoV-2 by cell culture or animal passage would have required prior isolation of a progenitor virus with very high genetic similarity, which has not been described. Subsequent generation of a polybasic cleavage site would have then required repeated passage in cell culture or animals with ACE2 receptors similar to those of humans, but such work has also not previously been described.

Erstens stellen die Autoren selbst zuvor Links zu Werken bereit, bei denen eine Furinstelle entstand, als Viren in Zellen kultiviert wurden. Und zweitens, was bedeutet es, dass ein ähnlicher Virusstamm nicht beschrieben wurde - aber was ist mit RaTG13? Wenn RBM darin synthetisch durch Pangolinium ersetzt würde und dann der chimäre Stamm in Zellkultur kultiviert würde, könnte die Furinstelle sowohl auf diese Weise entstehen als auch auf die gleiche Weise könnte der neue Stamm andere Mutationen erwerben, die CoV2 von RaTG13 und Pangolin-19 unterscheiden .

Aber in Bezug auf genau die künstliche Variante des Erscheinungsbilds der Furinstelle sehe ich die Option eher mit einer gezielten Einfügung - wie in einer anderen chinesischen Arbeit vom Oktober 2019 mit Hühnchen-Coronavirus. Und dann könnte der erzeugte Stamm neue Mutationen erwerben, wenn er in vitro kultiviert wirdoder in vivo beispielsweise als Mausstamm von MA15 im Jahr 2007.

Shi Zhengli 2020

Während ich diesen Artikel schrieb, kam die Arbeit eines großen Teams chinesischer Virologen, darunter Shi Zhengli, heraus, in der sie im Februar ihre langjährige Entwicklung gegen viele Arten von Coronaviren gegen CoV2 testeten - ein Peptid, das die Fusion eines spike-ähnlichen Proteins mit einer Zellmembran blockieren soll. Die Autoren erwähnen natürlich die neue Furinstelle von CoV2 und schlagen vor, dass sie eine wichtige Rolle bei der wesentlich effizienteren Penetration von CoV2 in die Zelle spielen kann:

, SARS-CoV-2 , SARS-CoV, , SARS-CoV-2 .
…
, β- S1/S2, . , SARS-CoV , L . S1/S2 SARS-CoV .
In this study, we have shown that SARS-CoV-2 exhibits much higher capacity of membrane fusion than SARS-CoV, suggesting that the fusion machinery of SARS-CoV-2 is an important target for development of coronavirus fusion inhibitors.
…
Generally, β-B coronaviruses lack the S1/S2 furin-recognition site, and their S proteins are uncleaved in the native state. For example, SARS-CoV enters into the cell mainly via the endosomal membrane fusion pathway where its S protein is cleaved by endosomal cathepsin L and activated. Inducing the S1/S2 furin-recognition site could significantly increase the capacity of SARS-CoV S protein to mediate cellular membrane surface infection.

In diesem Zusammenhang wird es interessant, aber haben die Autoren zuvor einige Experimente durchgeführt, wie die Zugabe neuer Furinstellen zu verschiedenen Coronaviren die Wirksamkeit ihres Peptids beeinflussen kann? Aber wir werden keine unnötigen Vermutungen anstellen, lassen Sie die Zeit alles an seinen Platz setzen.

By the way, Barik, offenbar beschlossen, mit Shi Zhengli Schritt zu halten, und auch verbunden , das Rennen Mittel aus COV2 zu finden. Soweit ich weiß, haben er und seine Co-Autoren Daten zur Wirksamkeit ihres Nucleosidanalogons (β-D-N4-Hydroxycytidin, NHC) gegen SARS-CoV und MERS, die sie bereits hatten, aufgenommen, In-vitro- Daten zu CoV2 hinzugefügt und an den Druck gesendet. Nukleosidanaloga (wie das berühmte Remdesivir) Ist ein grundlegend anderer Ansatz als der von Shi Zhengli und Co-Autoren: Hier versuchen die Autoren, die Replikation des Virus zu verhindern, indem sie „fehlerhafte“ Buchstaben des genetischen Alphabets verrutschen, und Shi Zhengli und Co-Autoren versuchen, das Eindringen des Virus in die Zelle zu verhindern. Theoretisch können diese Ansätze kombiniert werden.

Dies ist das Ende, schöner Freund

Oh, ich hoffe bis zu diesem Moment liest wenigstens jemand. Tut mir leid, wenn ich dich langweile. Selbst unter Schock: Das Kaninchenloch erwies sich als ein ganzes unterirdisches Königreich. Ich hoffe auch, dass es für Sie interessant war, in die Welt der Virologie einzutauchen und die Hypothese der künstlichen Natur von CoV2 offen zu betrachten. Meiner Meinung nach erlaubt der Datensatz, den ich insgesamt zitiert habe, diese Hypothese nicht abzulehnen.

Nur für den Fall, ich erkläre: Dies bedeutet NICHT, dass CoV2 im Labor präzise synthetisiert wurde. Ja, rein technisch wäre es für einen modernen Virologen nicht schwierig, eine solche Belastung zu erzeugen. Es gibt jedoch keine direkten Beweise dafür, dass jemand dies getan hat. Und seltsame Zufälle können noch nicht einmal als indirekter Beweis dienen.

Die umgekehrte Hypothese über die ausschließlich natürliche Natur des Virus wird jedoch auch noch nicht durch solide Beweise gestützt. Bisher wurden keine Zwischenvorfahren zwischen RaTG13, Pangolin-19 und CoV2 gefunden, bei denen es möglich wäre, die selektive Rekombination zu verfolgen, die wir in CoV2 beobachten. Die Frage nach ihrer Herkunft bleibt offen. Vielleicht spricht niemand besser als Ralph Barik selbst :

Welche Tiere sind zoonotische Träger von SARS-CoV-2?
Solche Tiere wurden noch nicht gefunden. Es gibt Hinweise darauf, dass Pangoline möglicherweise ein Zwischenwirt sein könnten, aber Pangolinviren sind nur zu 88–98% mit SARS-CoV-2 identisch. Zum Vergleich waren die Zibet- und Waschbären-Coronavirusstämme des ersten SARS zu 99,8% mit den SARS-CoV-Stämmen von 2003 identisch. Mit anderen Worten, wir sprechen über mehrere Mutationen zwischen Zibet-, Waschbären- und Menschenstämmen im Jahr 2003. Pangoline [CoV2-Stämme] weisen mehr als 3.000 Nukleotidveränderungen auf, sodass Pangoline in keiner Weise eine Reservoirspezies sein können. Absolut keine Chance.
Quellentext
What is the reservoir species of SARS-CoV-2?
They have not identified the actual reservoir species. Reports show that pangolins are potentially the intermediate host, but pangolin viruses are 88–98% identical to SARS-CoV-2. In comparison, civet and racoon dog strains of SARS coronaviruses were 99.8% identical to SARS-CoV from 2003. In other words, we are talking about a handful of mutations between civet strains, racoon dog strains and human strains in 2003. Pangolin [strains of CoV2] have over 3000 nucleotide changes, no way they are the reservoir species. Absolutely no chance.

So geht es.

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UPD: etwa 4% des Unterschieds zwischen den Genomen von RaTG13 und Cov2

Einige Kritiker der Laborhypothese haben argumentiert, dass der beobachtete genetische Unterschied von ~ 4% zwischen RaTG13 und CoV2 zu groß ist, als dass dies im Labor geschehen könnte, wenn RaTG13 selbst als Grundlage verwendet würde. Die beobachteten Mutationsraten für RNA-Viren variieren stark - von 10 bis ⁶ bis 10 bis ⁴ Nukleotiden pro In- vitro- Replikation , und beim Menschen scheint CoV2 mit einer Rate von 25 Mutationen pro Jahr zu mutieren. Nach der Logik der Kritiker würde es Jahre, wenn nicht Jahrzehnte dauern, bis diese beiden Stämme um 4% voneinander abweichen. Trotz der Tatsache, dass dies ein vernünftiger Einwand ist, sehe ich einige Probleme damit.

Erstens sind die In- vitro- Mutationsraten viel höher alsin vivo , da Sie Zellen viel häufiger passieren können als neue Tiere infizieren. Wie Experimente mit SARS und MERS in vitro gezeigt haben , können nach mehreren Passagen signifikante Mutationen beobachtet werden. Beispielsweise wurde in einem Artikel aus dem Jahr 2004 berichtet, dass nach 600 Passagen bereits 2,1% Unterschiede in den Genomsequenzen der spike-ähnlichen Proteine zwischen dem ursprünglichen Stamm und seinen Nachkommen beobachtet wurden:

Darüber hinaus wurden in Gegenwart einiger antiviraler Arzneimittel beispielsweise dieselben Nukleosidanaloga (Ribavirin oder Remdesivir) ) kann die Häufigkeit von Mutationen in der RNA - Viren erhöht dreifach:

. 10-4 , -. , 6 . in vitro , , , .
We obtained an estimate of the spontaneous mutation rate of ca. 10^-4 substitutions per site or lower, a value within the typically accepted range for RNA viruses. A roughly threefold increase in mutation rate and a significant shift in mutation spectrum were observed in samples from patients undergoing 6 months of interferon plus ribavirin treatment. This result is consistent with the known in vitro mutagenic effect of ribavirin and suggests that the antiviral effect of ribavirin plus interferon treatment is at least partly exerted through lethal mutagenesis.

Wenn also der Laborvorfahr von CoV2 getestet würde, um festzustellen, wie seine Mutagenese die Wirksamkeit potenzieller Impfstoffe oder antiviraler Medikamente gegen CoV2 verändern kann, könnte er sehr schnell signifikante Unterschiede akkumulieren.

Das vielleicht größte Problem mit dem Argument des Unterschieds von 4% ist jedoch, dass es auf der Tatsache beruht, dass der RaTG13-Stamm genau das ist, was WIV deklariert hat, und dass es keine anderen, engeren Stämme in ihrer Sammlung gibt. Wenn wir die Laborleckhypothese offen betrachten wollen, müssen wir zugeben, dass wir den Daten desselben Labors, bei denen der Verdacht auf Leckage besteht, nicht vollständig vertrauen können. Wenn das Leck aufgetreten ist, wie die Hypothese nahelegt, versucht die WIV bereits, es zu verbergen, und die von ihnen bereitgestellten Daten können durchaus dem gleichen Ziel folgen.

, 100%- , . , , , , , , , . — — CoV2 , , , , , . , , , . , , , , .

Übrigens gibt es etwas, das helfen könnte, die Behauptungen von WIV über die Natur von RaTG13 zu glauben - wenn sie sich bereit erklären, ihre Yunnan-Proben aus dem Jahr 2013, aus denen Shi Zhengli RaTG13 extrahiert hat, an unabhängige Laboratorien zu übertragen. Sie müssen sie noch haben, wenn sie 2020 das gesamte RaTG13-Genom von ihnen erneut sequenzieren wollen.

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UPD2: RaTG13 - der gleiche Stamm wie RaBtCoV / 4991?

Nachdem ich diesen Beitrag veröffentlicht hatte, wurde ich auf einen Vorabdruck hingewiesen, der besagt, dass RaTG13 tatsächlich ein Stamm von RaBtCoV / 4991 ( KP876546 ) sein kann, den Shi Zhengli 2013 in einer verlassenen Yunnan-Mine im Jahr 2016 entdeckt haben soll . Es gibt mehrere Gründe, dies zu glauben. Erstens ist die einzige veröffentlichte Sequenz aus RaBtCoV / 4991 zu 100% identisch mit der RaTG13-Sequenz auf Nukleotidebene , obwohl dies nur 370 Nukleotide aus dem RdRp-Gen sind:

Zweitens sind die Daten zur Sammlung von Material, aus dem diese Stämme isoliert wurden, nahezu identisch: Beide wurden im Juli 2013 von einem Fledermausabstrich von R. affinis gesammelt :

Eine Probe von RaBtCoV / 4991 wurde in einer Mine im Landkreis Mujiang gesammelt, die der Gerichtsbarkeit von Puer unterliegt:

Die autonome Region Mujiang ist eine autonome Region unter der Gerichtsbarkeit der Stadt Puer im Süden von Yunnan, China. Wikipedia

Und die Stadt Puer wird in der GISAID-Datenbank als Treffpunkt von RaTG13 angegeben, was möglicherweise ein ungefährer Hinweis auf den Standort der Mine in Mujiang ist.

Es ist seltsam, dass Shi Zhengli in seinem Artikel über RaTG13 aus dem Jahr 2020 RaBtCoV / 4991 nicht erwähnt und seinen Artikel aus dem Jahr 2016 über seine Entdeckung nicht zitiert , in dem er als „die Studie entwickelt und koordiniert“ bezeichnet wird. Gleichzeitig ist es unwahrscheinlich, dass RaBtCoV / 4991 vollständig vergessen wird, da es in einem Artikel der Shi Zhengli-Gruppe aus dem Jahr 2019 erwähnt wird, in dem es im phylogenetischen Baum anderer Coronaviren enthalten ist:

Ich bezweifle, dass der Platz von RaBtCoV / 4991 in diesem Baum ausschließlich auf der Grundlage eines Fragments von 370 Nukleotiden bestimmt wurde, daher denke ich, dass die Shi Zhengli-Gruppe bereits Anfang 2019 ihr Genom sequenziert hatte.

Übrigens ist es interessant, dass die Genome von Pangolin-2017 und Pangolin-2019 in dieser Region des RdRp-Gens auch sehr nahe an RaTG13 und CoV2 liegen und CoV2 und Pangolin-2019 mehrere häufige Mutationen aufweisen, die in RaTG13 nicht beobachtet wurden:

Ich beschloss auch, das Codonprofil zwischen RaTG13 und anderen Stämmen von R. affinis zu vergleichen, die in derselben verlassenen Mine leben. Leider wurden nur 816-Nucleotidsegmente aus dem RdRp-Gen ( RaBtCoV / 3750 und RaBtCoV / 4307–2 ) für andere Ra-Stämme veröffentlicht. Um die Codonpräferenzen zu vergleichen, extrahierte ich das entsprechende 816-Nucleotidsegment aus RaTG13. Infolgedessen ist RaTG13 wieder merklich anders, während die beiden anderen Stämme ziemlich nahe beieinander liegen:

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