📶 💪🏻 🔪 Keil für Keil: Verwendung des PIV5-Virus zur Herstellung eines Impfstoffs gegen MERS-CoV und möglicherweise gegen SARS-CoV-2 😲 👩🏽‍🚒 👩‍💻

Angesichts der gegenwärtigen Umstände ist es keineswegs überraschend, dass die wissenschaftliche Gemeinschaft alle ihre Kräfte auf die Suche und Entwicklung von Methoden und Werkzeugen zur Bekämpfung des sich ausbreitenden Virus konzentriert hat. Heute schauen wir uns eine Studie an, in der Wissenschaftler der American Society for Microbiology (ASM) einen sehr wirksamen Impfstoff gegen das MERS-Virus beschreiben, der sich 2012 zu verbreiten begann. Laut Wissenschaftlern kann ihre Entwicklung dazu beitragen, einen Impfstoff gegen das derzeit tobende SARS-CoV-2 zu entwickeln. Was ist die Besonderheit des erstellten Impfstoffs, aus dem er hergestellt wurde, und wie effektiv erfüllt er seine Aufgabe? Dies erfahren wir aus dem Bericht von Wissenschaftlern. Gehen.

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Studienbasis

MERS oder das Middle East Respiratory Syndrome ist eine entzündliche Erkrankung der Atmungsorgane, die sich aufgrund einer Infektion mit dem Virus der Gattung Betacoronavirus aus der heute bekannten Unterfamilie Coronavirinae entwickelt.

Schnappschuss von MERS-CoV (gelb).

Die Quelle des MERS-CoV-Virus sind wieder Fledermäuse. Die ersten Infektionsfälle bei Menschen wurden bereits 2012 auf dem Territorium der Arabischen Halbinsel registriert, aber bis 2015 hatte das Virus die Länder Ostasiens und Europas erreicht. Nach den neuesten Daten beträgt die Anzahl der bestätigten Fälle einer MERS-CoV-Infektion 2494 Personen, von denen 858 starben (Daten vom 02.02.2020). Die Daten variieren von Quelle zu Quelle, aber es ist deutlich zu sehen, dass der Verteilungsgrad in MERS-CoV nicht so groß ist wie in SARS-CoV-2. Dennoch weist das Nahostvirus auch eine relativ hohe Sterblichkeitsrate auf - etwa 35%. Dieser Indikator ist am besorgniserregendsten.

MERS-CoV ist ein positivkettiges RNA-Virus * , bei dem aufgrund des S-Proteins eine Penetration in Zielzellen erfolgtVirushülle * .

Positivketten- RNA-Virus * - Positive Virus-RNA. Dies impliziert, dass eine bestimmte virale RNA-Sequenz direkt in virale Proteine übersetzt werden kann (zum Beispiel Proteine, die für die Virusreplikation notwendig sind). Daher kann in RNA-Viren mit einer positiven Kette das virale RNA-Gen als virale mRNA (Messenger-RNA) betrachtet werden und es kann sofort von der Wirtszelle translatiert werden.

Virale Hülle * - eine zusätzliche Hülle, die die äußere Hülle (Kapsid) vieler Viren abdeckt.

Das S-Protein besteht aus der S1-Untereinheit, die für die Bindung an den Virusrezeptor Dipeptidylpeptidase 4 (DPP4 oder CD26) über die Rezeptorbindungsdomäne (RBD aus der Rezeptorbindungsdomäne ) verantwortlich ist, sowie der S2-Untereinheit, die die Membranfusion bereitstellt.

Forscher erinnern sich, dass es derzeit keinen Impfstoff gegen MERS-CoV gibt, es gibt nur eine Reihe von Entwicklungen, deren Wirksamkeit ziemlich zweifelhaft ist. Wissenschaftler glauben, dass ihre Arbeit diese Situation ändern wird.

In dieser Studie beschlossen die Wissenschaftler, ihre Aufmerksamkeit auf ein anderes Virus zu lenken - PIV5. PIV- oder Parainfluenza-Viren (PG) haben fünf Sorten, von denen drei beim Menschen Krankheiten verursachen (von PG-1 bis PG-3) und zwei, die für den Menschen nicht gefährlich sind (PG-4 und PG-5).

TEM-Momentaufnahme des Parainfluenza-Virus.

PG-5 gehört zur Gattung Rubulavirus aus der Familie der Paramyxoviridae, zu der das Mumps-Virus (MuV oder „Mumps“) sowie das humane Parainfluenza-Virus Typ 2 (PG-2) und Typ 4 (PG-4) gehören. PG-5 codiert acht bekannte virale Proteine. Nucleocapsid-Protein (NP), Phosphoprotein (P) und RNA-Polymerase-Protein (L) sind wichtig für die Transkription * und Replikation * des viralen RNA-Genoms.

Transkription * - der Prozess der RNA-Synthese unter Verwendung von DNA als Matrize; Übertragung genetischer Informationen von DNA auf RNA.

Replikation * ist der Prozess der Erzeugung von zwei Tochter-DNA-Molekülen basierend auf elterlicher DNA.

Wissenschaftler glauben, dass PG-5 ein ausgezeichneter Kandidat für virale Vektoren * für den zukünftigen Impfstoff ist. PG-5 ist trotz seines hohen Infektionsgrades, der bei der Herstellung eines wirksamen Impfstoffs in die Hände spielen kann, ziemlich sicher.

Virale Vektoren * sind Werkzeuge zur Abgabe von genetischem Material an Zielzellen.

Darüber hinaus weist PG-5 in seinem Lebenszyklus keine DNA-Phase auf, wodurch mögliche unbeabsichtigte genetische Veränderungen der Wirtszell-DNA durch Rekombination oder Insertion vermieden werden. Auch die Struktur von PG-5 ist im Gegensatz zu RNA-Viren mit einer positiven Kette ziemlich stabil. Dies wird durch das erzeugte rekombinante PG-5 bestätigt, das das F-Gen für das respiratorische Syncytialvirus exprimiert, wenn das F-Gen für mehr als 10 Generationen aufrechterhalten wurde.

Ein weiterer Vorteil von PG-5 ist seine Kosteneffizienz, da dieses Virus bis zu 8x10 ⁸ PFU / ml (PFU - Plaque bildende Einheiten) gezüchtet werden kann .

Zuvor wurde PG-5 bereits als viraler Vektor bei der Arbeit mit Impfstoffen gegen das respiratorische Syncytialvirus und die Tollwut verwendet. Während Experimenten an Mäusen wurde gefunden, dass der PG-5-Vektor, der die NA (Neuraminidase, die Teil der Membran ist) des Influenzavirus exprimiert, zu einer vollständigen Immunisierung der Versuchspersonen führt, d.h. 4 Tage nach der Infektion gab es keinen einzigen Todesfall oder gar eine Infektion. PG-5, das NP (Nucleoprotein) exprimiert, schützt jedoch 100% der experimentellen Mäuse vor dem tödlichen Stamm des H1N1-Influenzavirus.

Basierend auf solchen positiven Ergebnissen früherer Studien entschieden sich die Wissenschaftler, PG-5 als viralen Vektor zu verwenden, der das MERS-Virus-S-Protein exprimiert. Wie zuvor wurden alle Experimente an Mäusen durchgeführt.

Forschungsergebnisse

Die Forscher führten das HA-Gen (Hämagglutinin) des Influenza-A-Virus vorab an verschiedenen Stellen im PG-5-Genom ein und stellten fest, dass Inserts in SH (kleine hydrophobe) und HN (Hämagglutinin-Neuraminidase) eine bessere Immunantwort ergeben.

Influenzavirus-Hämagglutinin und Neuraminidase * sind Oberflächenantigene des Virus, die die Fähigkeit bieten, sich an Zielzellen zu binden.

Vor diesem Hintergrund wurde beschlossen, das S-Gen in voller Größe des MERS-Virus an der Schnittstelle von SH und HN einzuführen. Ein Plasmid *, das cDNA * PG-5 voller Länge mit einem inserierten S-Gen an der Verbindung von SH und HN enthielt, wurde unter Verwendung von Standardverfahren zur molekularen Klonierung ( 1A ) konstruiert .

Bild Nr. 1

Plasmid * ist ein kleines DNA-Molekül, das von den Chromosomen getrennt ist und unabhängig replizieren kann.

cDNA * - komplementäre DNA, d.h. DNA, die auf einer Matrix aus reifer mRNA (Messenger-RNA) in einer durch reverse Transkriptase katalysierten Reaktion synthetisiert wurde.

Das Plasmid wurde zusammen mit Plasmiden, die die TG-, NP-, P- und L-RNA-Polymerase des PG-5-Virus (PIV5) exprimieren, in BHK * -Zellen transfiziert .

Transfektion * - Einführung von Nukleinsäure in Zellen durch eine nicht-virale Methode.

BHK-Zellen * ( Baby-Hamsterniere ) sind Bindegewebszellen (Fibroblasten) von Hamsternieren, die gegenüber vielen Viren, die Menschen betreffen, empfindlich sind. BHK-Zellen werden zur Transformation sowie für stabile und transiente Transfektionen verwendet.

Das Ergebnis war das infektiöse Virus PIV5-MERS-S, das zur weiteren Analyse in MDBK-Zellen * weiter gereinigt und in großer Anzahl multipliziert wurde .

MDBK-Zellen * ( Madin-Darby- Hundenierenzellen ) - Hundenierenzellen , die erstmals 1958 von den Wissenschaftlern SH Madin und NB Darby isoliert wurden. Diese Zellen werden in der Forschung als Modellsäugetierzellen verwendet.

Das Virusgenom wurde sequenziert und bestätigt, dass es die gewünschte eingegebene DNA-Sequenz enthält. Als nächstes war es notwendig, die Expression von S-Protein in mit PIV5-MERS-S infizierten Zellen zu überprüfen. Zu diesem Zweck wurden die Zellen mit verschiedenen MOI * -Werten infiziert , wonach sie zum Immunblotting * unter Verwendung eines Anti-S-Antikörpers lysiert (gelöst) wurden .

MOI * ( Infektionsmultiplizität ) - die Infektionsmultiplizität, d.h. das Verhältnis von Wirkstoffen (Virus) zu Infektionszielen (Zellen).

Immunoblotting * ist eine hochempfindliche Methode zum Nachweis von Proteinen, die auf einer Kombination aus Elektrophorese und Enzymimmunoassay oder Radioimmunanalyse basiert.

Die Analyse zeigte das Vorhandensein von sowohl vollständigem S-Protein als auch S2-Fragmenten, was auf den Erfolg seiner Implementierung hinweist ( 1B ). Die S-Proteinexpression in PIV5-MERS-S-infizierten Zellen wurde weiter durch Immunfluoreszenzanalyse ( 1C ) bestätigt.

Wissenschaftler stellen fest, dass PIV5-MERS-S eine massive Syncytium * -Bildung in Vero * -Zellen verursachte . Darüber hinaus war die Wachstumskinetik von PIV5-MERS-S und herkömmlichem PG-5 (PIV5) sehr ähnlich ( 1D ).

Syncytium * ist eine Art von Gewebe, in dem Zellen nicht vollständig getrennt sind, d.h. Es gibt Abschnitte des Zytoplasmas mit Kernen, die durch Plasmodesmen (zytoplasmatische Brücken) miteinander verbunden sind.

Vero* — , .

Bild Nr. 2

Immunisierung PIV5-MERS-S erzeugt neutralisierende Antikörper und T-Zell-vermittelte Immunität. Um zu bestimmen, ob PIV5-MERS-S Immunantworten erzeugen kann, wurden Mäuse mit einer Einzeldosis PIV5-MERS-S oder Kontroll-PIV5-GFP-Virus mit 10 ⁴ PFU oder 10 ⁶ PFU pro Individuum über den intranasalen Weg immunisiert .

Während beide Dosen Antikörperreaktionen hervorriefen, waren die neutralisierenden Titer bei 1:64 und 1: 128 für 10 ⁴ bzw. 10 ⁶ Dosen ( 2A und 2B ) bescheiden .

Wissenschaftler erinnern sich, dass Mäuse der Spezies C57BL / 6 und BALB / c nach der Immunisierung Th1- bzw. Th2-dominante Immunantworten erzeugen.

Th (T-Helfer) - T-Lymphozyten, die die adaptive Immunantwort verstärken (erworbene Immunität).

Th1 - fördert die Entwicklung einer zellulären Immunantwort durch Aktivierung von Makrophagen.

Th2 - B-Lymphozyten aktivieren, was zur Entwicklung einer humoralen Immunantwort beiträgt.

Eine Dosis PIV5-MERS-S (10 ⁶ PFU) führte bei BALB / c ( 2C ) -Mäusen zu einem Titer neutralisierender Antikörper von bis zu 1: 2000 , was mit der Th2-dominanten Reaktion bei Mäusen dieser Spezies übereinstimmt.

Um die primäre Antwort von CD8 * T-Zellen zu bewerten, die durch Immunisierung mit PIV5-MERS-S erzeugt wurden, wurden hDPP4-KI-Mäuse intranasal mit PIV5-MERS-S (10 ⁴ PFU) immunisiert .

CD8* ( 8) — , - .

Vier Wochen später wurde ein Zaun genommen, um das Vorhandensein / Fehlen von MERS-CoV-spezifischen pulmonal residenten CD8-T-Zellen ( 3A ) zu untersuchen.

Bild Nr. 3

Wie in 3B - 3D gezeigt , gab es einen signifikanten Anstieg des Prozentsatzes und der Gesamtzahl von CD8-IFN-Zellen in der Lunge von mit PIV5-MERS immunisierten Mäusen im Vergleich zu denen, die mit PIV5-GFP infiziert waren.

Um die Reaktion von MERS-S-spezifischen CD8-T-Zellen zu bewerten, wurde eine zusätzliche MERS-CoV- _MA- Injektion durchgeführt (10 ⁴ PFU). Als Ergebnis wurde ein signifikanter Anstieg der Reaktion von CD8-T-Zellen am vierten Tag im Vergleich zu Mäusen beobachtet, die mit der Kontrolle PIV5-GFP ( 3E - 3G) infiziert waren)

Ein 10-facher Anstieg der MERS-S-spezifischen CD8-T-Zellen wurde auch im Vergleich zur primären Antwort von CD8-T-Zellen ( 3B - 3G ) beobachtet.

Bild Nr. 4

Als Ergebnis der PIV5-MERS-S-Immunisierung wird der Tod einer Infektion bei Mäusen verhindert. Um die Wirksamkeit von PIV5-MERS-S bei der Prävention oder Modifikation des MERS-CoV-Virus zu bestimmen, wurden hDPP4-KI-Mäuse intranasal mit PIV5-MERS-S (10 ⁴ PFU) immunisiert .

4 Wochen nach der Immunisierung wurden die Mäuse mit MERS-S infiziert, das so modifiziert war, dass es in Mäusen aktiver war ( 4A ). Alle mit PIV5-MERS-S immunisierten Mäuse überlebten diese tödliche Infektion mit leichtem Gewichtsverlust ( 4B und4C ). Im Gegensatz dazu starben alle mit der Kontrolle PIV5-GFP oder PBS infizierten Mäuse nach der Infektion. Dies zeigt an, dass PIV5-MERS-S Mäuse vollständig vor tödlichen Infektionen schützte.

Trotz der Tatsache, dass PIV5-MERS-S-immunisierte Mäuse eine höhere Rate an Lungenclearance vom Virus aufwiesen, lieferte diese Methode keine vollständige sterilisierende Immunität ( 4D ).

Bild Nr. 5

Histopathologische Untersuchungen der Lunge nach der Infektion zeigten, dass mit PIV5-MERS-S immunisierte Mäuse signifikant weniger Zelltrümmer * und mehr mononukleäre Infiltrate aufwiesen ( 5A und 5B ).

Zelltrümmer * sind der Rest der Zelle, der von einer Plasmamembran umgeben ist, die von Makrophagen phagozytiert wird.

Es wurde auch eine starke Leukozyteninfiltration (hauptsächlich mononukleäre Zellen) und eine geringere Schädigung (Ödeme, hyaline Membranen, nekrotische Zelltrümmer usw.) festgestellt.

Im Endstadium der Studie bewerteten die Wissenschaftler die durch PIV5-MERS-S oder inaktiviertes MERS-CoV induzierten Schutzreaktionen. Zu diesem Zweck wurden einige Mäuse mit PIV5-MERS-S (10 ⁴ PFU) oder PBS immunisiert, während andere mit UV-inaktiviertem MERS-CoV immunisiert wurden.

Während PIV5-MERS-S einen 100% igen Schutz gegen tödliche Infektionen bot, schützte inaktiviertes MERS-CoV nur 25% der Mäuse (Bild unten).

Bild Nr. 6

Als nächstes wurde eine Studie an den Lungen von Mäusen durchgeführt, die zuerst immunisiert und dann mit MERS-CoV infiziert wurden (Bild unten).

Bild Nr. 7

Bei Mäusen, die mit inaktiviertem MERS-CoV immunisiert waren, wurden in der Lunge mehr Eosinophile (eine Art weißer Blutkörperchen) beobachtet als bei Mäusen, die nach Infektion mit MERSCoV mit PBS oder PIV5-MERS-S immunisiert waren.

Im Vergleich zu PBS war die perivaskuläre eosinophile Infiltration in der inaktivierten MERS-CoV-Gruppe signifikant erhöht, es wurde jedoch kein statistischer Unterschied im Vergleich zu der mit PIV5-MERS-S immunisierten Gruppe beobachtet.

Es wurde auch die Bildung einer hyalinen Membran in den Lungenbläschen untersucht, was ein deutliches Zeichen für eine schwere Lungenerkrankung ist. Im Vergleich zur PBS-Gruppe zeigten mit PIV5-MERS-S immunisierte Mäuse einen signifikanten Schutz gegen die Bildung einer hyalinen Membran. Die mit inaktiviertem MERS-CoV immunisierten Mäuse zeigten jedoch nur eine geringe Abnahme der Bildung der hyalinen Membran, was auf die geringe Effizienz dieser Immunisierungsmethode im Vergleich zu PIV5-MERS-S hinweist.

Um die Nuancen der Studie genauer kennenzulernen, empfehle ich Ihnen, den Bericht von Wissenschaftlern zu lesen .

Epilog

In dieser Arbeit konnten Wissenschaftler eine recht erfolgreiche Methode zur Immunisierung von Mäusen mit dem MERS-CoV-Virus demonstrieren, das seit 2012 frei auf unserem Planeten läuft.

Das Hauptunterscheidungsmerkmal der entwickelten Methode ist die Verwendung eines anderen Virus, nämlich PG-5, als viralen Vektor. Mit anderen Worten, der Keil wird durch einen Keil ausgeschlagen.

Die Verwendung des Virus als Transportmittel für die Abgabe von Genen, die für die Immunisierung erforderlich sind, kann als eher ungewöhnliche Methode angesehen werden, kann jedoch zu einer wirksameren Bekämpfung von Viren beitragen. Die Forscher selbst sagen, dass ihre Arbeit nicht nur auf die Bekämpfung von MERS-CoV abzielt, sondern auch auf SARS-CoV-2 (COVID-19). Beide Viren gehören zur selben Unterfamilie, haben ähnliche Infektionswege und Auswirkungen auf Zielzellen. Wenn die entwickelte Immunisierungsmethode weiterentwickelt wird, kann möglicherweise ein ausreichend wirksamer Impfstoff hergestellt werden.

Dies ist, was die Autoren dieser Arbeit in Zukunft planen. Ob es ihnen gelingt, einen Superimpfstoff zu entwickeln oder nicht, wird die Zeit zeigen. Jetzt verdienen sie jedoch jegliches Lob, zumindest dafür, dass sie auf das Virus geachtet haben, das jeder zu vergessen schien.

Wie dem auch sei, wir können nur hoffen, dass die Wissenschaft und alle Beteiligten, wie schon oft zuvor, alle Vorurteile und Ängste überwinden, alle Hindernisse überwinden und zeigen können, dass analytisches Denken, das auf Wissen und Logik basiert, immer dazu in der Lage ist Finden Sie einen Ausweg aus jeder aktuellen Situation, egal wie schrecklich sie auf den ersten Blick sein mag.

Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit, bleiben Sie neugierig und haben Sie eine gute Arbeitswoche, Jungs.

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