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"Schau, das ist etwas": Selbstreplikation künstlicher DNA



Eines der Hauptunterscheidungsmerkmale eines lebenden Organismus ist die Fähigkeit, die notwendigen Informationen zu speichern und zu reproduzieren, um ihre eigene Art zu erzeugen. Dies manifestiert sich hauptsächlich in der DNA-Replikation, wenn zwei Tochterpaare aus derselben Eltern-DNA stammen, die eine exakte Kopie ihres Vorläufers sind. In der Natur wird dieser Prozess überall beobachtet, aber es ist äußerst schwierig, ihn unter Laborbedingungen von Grund auf neu zu erstellen. Er ist jedoch ziemlich realistisch.

Wissenschaftler des Instituts für Biochemie. Max Planck (Deutschland) hat erfolgreich ein biologisches System geschaffen, das die Fähigkeit besitzt, seine eigene DNA zu replizieren. Welche Techniken wurden verwendet, um synthetische replizierende DNA zu erzeugen, wie effektiv ist das resultierende System und was bedeutet diese Entdeckung für die moderne synthetische Biologie? Antworten auf diese Fragen finden wir im Bericht der Wissenschaftler. Gehen.

Studienbasis


Auf dem Gebiet der Schaffung künstlicher biologischer Systeme ist die Fähigkeit zur Replikation ein Schlüsselaspekt für die Nützlichkeit des geschaffenen Systems. Laut Wissenschaftlern kann dies durch die Implementierung der Grundkomponenten erreicht werden: Replikation * , Transkription * und DNA- Translation * .
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Mit anderen Worten, um ein vollwertiges künstliches Leben zu schaffen, ist es notwendig, eine selbstcodierte Reproduktion zu implementieren, d.h. Selbstreplikation. Dies ist ein äußerst komplizierter und verwirrender Prozess.

Die Autoren der Studie stellen fest, dass in Systemen, die auf der vorhandenen Biochemie basieren, beispielsweise MPC ( Minimal Protein Based Cells) , die Selbstreplikation ein vollständiges Umdenken der Molekularbiologie erfordert, einschließlich Replikation, Transkription und Translation von DNA unter Berücksichtigung einer vollständig zellfreien Umgebung.

Die Synthese von Protein aus DNA kann in bestimmten rekombinanten Systemen erreicht werden, die auf Phagen * RNA-Polymerasen basieren - den Hauptteilen des Translationsmechanismus von Escherichia coli und dem System der minimalen Energierückgewinnung, d.h. PURE - Proteinsynthese mit rekombinanten Elementen (Proteinsynthese unter Verwendung rekombinanter Elemente).
Bakteriophagen oder Phagen * sind Viren, die selektiv Bakterien- und Archaealzellen infizieren. In der Biologie wird es als Vektor verwendet (DNA zur Übertragung von genetischem Material in die Zelle).
In der Zwischenzeit bleibt es äußerst schwierig, den Prozess der DNA-Replikation des Genoms basierend auf Transkription und Translation (TTcDR - Transkription - translationsgekoppelte DNA-Replikation ), der alle makromolekularen Komponenten des PURE-Systems unter Verwendung eines selbstcodierten Replikoms * codiert, nachzubilden .
Replisoma * ist ein Multiproteinkomplex , der bakterielle DNA repliziert.
Eine DNA-Replikation basierend auf DNA-Polymerasen (DNAP) aus Phagen (z. B. Phi29) kann helfen, die TTcDR-Technik zu implementieren.

Bei der TTcDR-Methode konnte das Phi29-Genom in voller Größe jedoch nur erreicht werden, indem einige der Replikationsfaktoren blockiert wurden.

Alle oben genannten Methoden haben ihre theoretischen Vorteile, in der Praxis ergaben sie jedoch kein vollständiges Ergebnis. In der Arbeit, die wir heute betrachten, beschreiben Wissenschaftler ein Übersetzungssystem, das die selbstkodierte Replikation und Expression großer DNA-Genome unter genau definierten zellfreien Bedingungen ermöglicht. Insbesondere wurde eine Selbstreplikation des Genoms von über 116 kb erreicht. (tausend Nukleotidpaare), die das gesamte Spektrum der Translationsfaktoren Escherichia coli abdecken(Escherichia coli), alle drei ribosomalen RNAs, das Energierückgewinnungssystem sowie RNA- und DNA- Polymerasen * .
Polymerase * ist ein Enzym, das die Synthese von Polymeren von Nukleinsäuren durchführt. DNA-Polymerase synthetisiert DNA und RNA-Polymerase synthetisiert RNA. Dieser Prozess erfolgt durch komplementäres Kopieren von elterlicher DNA oder RNA.
Darüber hinaus demonstrierte das erstellte System die Fähigkeit, mehr als 30 Translationsfaktoren zu synthetisieren, von denen die Hälfte in Mengen ausgedrückt wird, die gleich oder größer als die einleitenden sind.

Forschungsergebnisse


In der ersten Phase testeten die Wissenschaftler das selbstkodierte Phi29-DNAP-abhängige TTcDR unter Verwendung des Standardprotokolls des PURExpress- Systems .

Die vom * T7- Promotor flankierte Phi29-DNAP-kodierende Region wurde zuerst in den pCR-Blunt-TOPO-Vektor (pREP, 1a ) kloniert .
Promotor * ist eine DNA-Nukleotidsequenz, die von der RNA-Polymerase als Region für die Transkriptionsinitiierung verwendet wird.


Bild Nr. 1

Theoretisch sollte diese Architektur eine spontane RNA- Replikation als rollender Ring * unter Verwendung von selbstkodiertem DNAP ohne zusätzliche Replikationsproteine ​​oder extern bereitgestellte DNA-Primer bereitstellen .
Rolling Ring Type Replication * ist ein unidirektionaler Nukleinsäurereplikationsprozess, bei dem eine schnelle Synthese mehrerer Kopien von Ring-DNA- oder RNA-Molekülen stattfindet.
Unter Verwendung der Standard-PURExpress-Reaktion mit dNTP (Nucleotid, das C 5 H 10 O 4 -Desoxyribose enthält) und 4 nM pREP (LB-Medium, ergänzt mit Zeocin C 55 H 86 N 20 O 21 S 2 ) wurde die DNA-Synthese unter Verwendung von nicht nachgewiesen Agarosegelelektrophorese * oder durch Echtzeit-Polymerasekettenreaktion * ( 1b und 1c ).
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Um die DNA-Replikation ohne die Beteiligung spezialisierter PURE-Systeme zu verbessern, wurde beschlossen, das Standard-PURExpress-Reaktionsprotokoll zu optimieren. Hierzu wurde die relative Anzahl von Translationsfaktoren, Ribosomen und einem Reduktionsmittel erhöht, während die Spiegel von tRNA (Transport-RNA) und rNTP (Ribonukleosidtriphosphat) ( 1d ) gesenkt wurden .

Mit dieser optimierten PURE-Zusammensetzung (PURErep) konnte eine 5–12-fache Replikation von pREP-Monomereinheiten in den TTcDR-Reaktionen erreicht werden ( 1b und 1e ). Die pREP-Synthese in voller Größe wurde durch MluI-Verdau * des Replikationsprodukts ( 1c ) bestätigt.
MluI * ist eine im Handel erhältliche Restriktionsendonuklease, d.h. ein Enzym, das die Hydrolyse von Nukleinsäuren katalysiert.
Die Expression von grün fluoreszierendem Protein (sfGFP) wurde als Bewertungsfaktor für die Translationsaktivität verwendet. Es wurde gefunden, dass eine Änderung der Zusammensetzung von PURE zu einer Verringerung der Proteinsynthese um 20-40% im Vergleich zu PURE ohne TTcDR führte. Diese Abnahme der Proteinexpression bleibt jedoch angesichts der verbesserten Kompatibilität des PURErep-Systems mit der DNA-Replikation akzeptabel.

Die Analyse der DNA-Replikation basierend auf qPCR ergab eine stabile Verdopplungszeit (1-2 Stunden) für verschiedene anfängliche Matrixkonzentrationen, während die DNA-Replikation auch nach 24 Stunden bei 30 ° C fortgesetzt wurde ( 1e ).

TTcDR war auch für mehr als fünf Generationen sequentieller Verdünnung stabil, wenn nur 4% des fertigen PURErep / pREP-Reaktionsprodukts direkt auf das neue PURErep-Gemisch ( 1f) übertragen wurden) Die Hauptschlussfolgerung dieser Beobachtung ist, dass TTcDR-Produkte über mehrere Generationen als Matrizen für die DNA-Selbstreplikation dienen können.

Wissenschaftler stellen fest, dass die Replikation nach Art des Rollrings durch eine signifikante Menge an Produkt mit geringer elektrophoretischer Mobilität gekennzeichnet ist, die während der Experimente beobachtet wurde. Diese Reaktionsprodukte können durch hochmolekulare Concatemere * und / oder DNA / MgPPi-Cluster dargestellt werden.
Concatemer * - mehrere Kopien von DNA-Sequenzen, die in einem sequentiellen Cluster zusammengesetzt sind.
Die Bildung von Produkten mit einer Größe von ~ 5 kb wurde ebenfalls nachgewiesen. in unbehandelten Proben. Daraus folgt, dass TTcDR-Reaktionen signifikante Mengen an pREP-Monomerkopien erzeugen können.

Darüber hinaus konnten Wissenschaftler E. coli- Produkte nach Entfernung des Elternplasmas transformieren . Die resultierenden gereinigten Reaktionsprodukte waren in der Größe mit den monomeren pREPs identisch.

In der nächsten Phase beschlossen die Wissenschaftler, eine Reihe von Genen zu entwickeln, die die wichtigen Komponenten der PURE-Reaktion codieren: 31, einen essentiellen Translationsfaktor (FT) von E. coli- Bakterien .

Hierzu wurde TTcDR aus pREP (4,6 kb) in Verbindung mit jedem der drei großen Plasmide * untersucht: pLD1 (30 bp, 13 FT), pLD2 (20 bp, 8 FT) und pLD3 (23 bp, 9 FT). Alle von ihnen wurden kloniert, um eine rekombinante Expression von 30 der 31 Translationsfaktoren von E. coli- Bakterien bereitzustellen .
Plasmide * sind kleine DNA-Moleküle, die unabhängig replizieren können.
TTcDR-Produkte aller vier Plasmide (einschließlich pREP) zeigten identische MluI-Restriktionsmerkmale: klonale Plasmide, die typischerweise in E. coli vermehrt werden ( 2a ).


Bild Nr. 2

Es ist auch erwähnenswert, dass pLD-TTcDR-Produkte direkt in E. coli transformiert werden können , wo sie als monomere Plasmide gelagert werden.

Das modifizierte PURErep-Gemisch lieferte auch eine vollständige Replikation aller drei pLD-Plasmide zusammen mit PURErep während der Reaktion in einem gemeinsamen Medium ( 2b ).

Die Wissenschaftler hörten hier nicht auf und versuchten bereits in der nächsten Phase der Studie, die genetische Belastung des TTcDR-Systems durch Co-Replikation von Plasmiden zu erhöhen, die zusätzliche Komponenten des PURE-Systems codieren: EF-Tu (pEFTu), das im pLD-System fehlt, sowie das ribosomale RNA- Operon * rrnB ( prRNA ist eine Vorläufer-rRNA, die 23S-rRNA (ribosomale RNA), 16S-rRNA, 6S-rRNA und tRNA (Transport-RNA, in diesem Fall Glu2) codiert ( 2c ).
Operon * ist eine funktionelle Einheit des einzelligen Genoms, das Gene umfasst, die für Proteine ​​kodieren.
QPCR-Experimente, die auf Plasmid-spezifische Amplikons * abzielten, bestätigten, dass die Monomereinheiten aller sechs Plasmide (die Gesamt-DNA-Länge betrug 93 kb) im Vergleich zur ursprünglichen Anzahl ( 2c ) etwa 2-8-mal replizierten .
Amplicon * ist eine extrachromosomale Amplifikationseinheit ( Kopieren von DNA-Schnitten).
Eine zusätzliche Bestätigung des Erfolgs der gemeinsamen Plasmidreplikation war die Bildung von Kolonien, die entweder gegen Zeocin (pREP) oder gegen Kanamycin (Plasmide pLD und prRNA) oder gegen Carbenicillin (pEFTu) resistent waren. Diese Kolonien waren das Ergebnis der Transformation von mit DpnI ( 2d ) behandelten PURErep-Reaktionsprodukten .

Die ausgewählten 26 klonalen Kolonien, gefolgt von einer Restriktionsanalyse, bestätigten erneut den Erfolg des TTcDR aller sechs Plasmide ( 2e ).

Unter Verwendung der gleichen Methode wie zuvor beschrieben führten die Wissenschaftler ein anderes Verfahren zur gemeinsamen Replikation von fünf zusätzlichen Plasmiden durch: Gene für das minimale Regenerationssystem von Nucleosidtriphosphat auf der Basis von Kreatinkinase (pCKM), Adenylatkinase (pAK1) und Nucleosiddiphosphatkinase (pNDK); sowie T7-RNA-Polymerase (T7RNAP) und Pyrophosphatase (pIPP).


Bild Nr. 3

Mit einer Gesamtgröße von 116,3 kb Dieser Satz von 11 Plasmiden erreicht> 100% der geschätzten Genomlänge, die für ein minimales, selbstreplizierendes System vorgeschlagen wurde, das nur von Nährstoffen mit niedrigem Molekulargewicht abhängt ( 3a ).

Die Wissenschaftler beschlossen dann zu prüfen, ob PURErep während der Replikation eine parallele Genexpression liefern kann. Hierzu wurde die multicistronische Expression von FT untersucht, die auf drei pLD-Plasmiden codiert ist: pLD1, pLD2 und plD3 (ohne pEFTu).

Um zu untersuchen, ob PURErep die multicistronische Expression dieser Plasmide im Allgemeinen unterstützen kann, wurde von jedem einzelnen Plasmid in Gegenwart von BODIPY-Lys-tRNALys eine zellfreie Expression durchgeführt, die eine Fluoreszenzmarkierung von Translationsprodukten ermöglicht.

Um die Nachweisempfindlichkeit zu verbessern und die Quantifizierung neu synthetisierter Proteine ​​zu ermöglichen, wurde eine quantitative Analyse der Proteinexpression basierend auf Massenspektrometrie unter Verwendung stabiler Isotopenmarkierungen durchgeführt.


Bild Nr. 4

Diese Analyse lieferte überzeugende Beweise für die Synthese aller FT-Untereinheiten von Proteinen, die von pLD codiert werden ( 4a ). Eine teilweise oder vollständige Regeneration von Proteinen, die sowohl in pLD2 als auch in pLD3 codiert sind, wurde ebenfalls beobachtet.

Die Analyse der Expression zeigte, dass selbst in nicht modifiziertem PURErep in Kombination mit pREP eine vollständige Replikation von 32 FT-Cidronen, die von pLD codiert werden, und eine Expression von etwa der Hälfte der codierten FT-Peptidketten vorliegt, deren Anzahl der ursprünglichen entspricht oder diese überschreitet.

Um sich eingehender mit den Nuancen der Studie vertraut zu machen, empfehle ich Ihnen, den Bericht von Wissenschaftlern und zusätzliche Materialien zu lesen.

Epilog


In dieser Arbeit gelang es den Wissenschaftlern, das zu erreichen, wovon viele ihrer Kollegen bisher nur träumen konnten - ein künstliches System zu schaffen, das sich selbst replizieren kann.

Übertrieben bedeutet dies, dass sie die ersten Schritte zur Schaffung eines Systems unternehmen konnten, das sich selbst reproduziert und so biologische Prozesse so weit wie möglich simuliert.

Die Autoren der Studie sind äußerst zufrieden mit den Ergebnissen und planen, das künstliche Genom in Zukunft um weitere DNA-Segmente zu erweitern. Sie wollen ein System mit einer Hülle schaffen, die ihre Lebensfähigkeit durch Aufnahme von Nährstoffen und Entsorgung von Abfall erhalten kann. Eine solche künstliche Struktur kann als spezielles Produktions-Biogerät für natürliche Substanzen oder als Grundlage für die Schaffung noch komplexerer Systeme verwendet werden.

Das Klonen ist ein komplexer Prozess, an dem es keinen Zweifel gibt, aber die Schaffung eines vollständigen, lebensfähigen synthetischen Systems ist eine völlig andere Ebene. Jemand wird sagen, dass solche Studien gefährlich sind, weil niemand das Recht hat, die Verantwortung von Mutter Natur zu übernehmen. Es ist jedoch fast unmöglich, die Neugier eines Menschen zu beruhigen. Unser Wunsch, alles zu verstehen und alles zu wiederholen, ist einer der treibenden Faktoren für den Fortschritt der Wissenschaft. Zum Guten oder Schlechten ist dies eine Frage, auf die es keine einzige Antwort gibt. Wir können nur die Errungenschaften kluger Köpfe bewundern und vorsichtig in die Zukunft schauen, während wir auf eine Utopie hoffen.

Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit, bleiben Sie neugierig und wünschen Sie allen ein schönes Wochenende! :) :)

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