👰🏼 💲 🌯 سارس معجزة؟ علم الأنساب من ووهان Coronavirus ⛹️ 🤠 👨🏼‍🔧

لا ، حسنا ، ما هو من صنع الإنسان؟ أي نوع من الهراء؟ فكرت عندما سمعت لأول مرة الفرضية القائلة بأن Kovid-19 كان ناتجًا عن تسرب مختبري ، أو حتى عن طريق هجوم بيولوجي مستهدف. وفي كل مرة يرفض ببساطة هذه التكهنات عندما يسبحون لي مرة أخرى في تيار عاصف من فيروسات التاجية. حسنًا ، فكر في الأمر ، هناك معهد للفيروسات في ووهان ، لا تعرفه أبدًا.

في مرحلة ما ، كان من الضروري بالفعل رفضه بشكل معقول ، لأن مؤيدي جنون الإنسان بدأوا في إثبات أطروحاتهم حول الطبيعة الاصطناعية المحتملة للفيروس بحجج من البيولوجيا الجزيئية ، وهنا أردت بالفعل تحطيم نظريات المؤامرة الخاصة بهم بالحقائق العلمية الباردة. حسنًا ، إن لم يكن كمؤلفين لمقال في الطبيعة (يبدو لي) ، فعلى الأقل كما احترمني بانشين .

وهنا ، سعياً وراء الحجج ضد الفيروس من صنع الإنسان ، أصابني فيروس الشك. ما هو في الواقع سبب الشك؟ حقيقة أنه كلما تعمقت في أنشطة علماء الفيروسات التاجية على مدى السنوات 15-20 الماضية ، كان من الأفضل أن تفهم أن إنشاء مثل هذه الوهمات بالضبط مثل CoV2 كان أمرًا شائعًا فيها. و CoV2 عبارة عن كميرا واضحة ، تستند إلى سلالة الخفافيش من RaTG13 ، حيث يتم استبدال موقع ربط المستقبلات (RBM) في بروتين السنبلة من الخفاش بواسطة البنجولينيوم ، بالإضافة إلى ذلك ، يتم إدخال قسم خاص من 4 أحماض أمينية ، مما يخلق موقعًا للانقسام الفيني ، والذي ، مثل وقد اكتشف علماء الفيروسات سابقًا أن يوسع بشكل كبير "ذخيرة" الفيروس من حيث الخلايا التي يمكن أن يخترقها.على الأرجح ، بفضل موقع Furin الجديد هذا ، تمكن المتحور الجديد من القفز من شركات النقل الأصلية إلى الناس.

مع الأخذ في الاعتبار الارتفاعات التي وصلت إليها الهندسة الوراثية اليوم ، فإن تركيب CoV2 باستخدام الطريقة الموضحة أعلاه لن يكون صعبًا حتى بالنسبة لأخصائي مبتدئ. في الواقع ، شارك علماء الفيروسات ، بما في ذلك شي Zhengli ، رئيس قسم الفيروسات التاجية في معهد ووهان للفيروسات ، مرارًا وتكرارًا في مثل هذه الأشياء - مثل استبدال RBM في أحد أنواع الفيروسات بـ RBM من نوع آخر(هذا هو عمل مجموعة Shi Zhengli من عام 2007) ، وإضافة موقع جديد للفيورين يمكن أن يمنح الفيروس التاجي الخاص بنوع واحد من الحيوانات الفرصة لبدء استخدام مستقبلات ACE2 من الأنواع الأخرى.

دقيقة العناية UFO

تم الإعلان رسمياً عن وباء COVID-19 الوبائي ، وهو عدوى تنفسية حادة حادة محتملة ناجمة عن الفيروس التاجي SARS-CoV-2 (2019-nCoV) ، في العالم. هناك الكثير من المعلومات حول حبري حول هذا الموضوع - تذكر دائمًا أنه يمكن أن يكون موثوقًا / مفيدًا ، والعكس صحيح.

نحثك على انتقاد أي معلومات منشورة.

مصادر رسمية
C
C
()

, .

اغسل يديك ، ورعاية أحبائك ، والبقاء في المنزل كلما أمكن ذلك والعمل عن بعد.

قراءة المنشورات حول: فيروسات التاجية | العمل عن بعد

شي Zhengli في مختبره في معهد ووهان للفيروسات

ولكن قبل تربية المؤامرة هنا ، دعونا نتعمق في السيرة الذاتية .

مادة الاحياء

لذا ، لنبدأ من الموقد. أي نوع من مواقع الفوران ، أي نوع من أنواع RBM ، أي نوع من بروتين السنبلة بشكل عام؟ في الواقع ، إذا كنت تخوض في غابة المصطلحات ، فإن كل شيء بسيط من الناحية المفاهيمية. على سبيل المثال ، البروتين الشائك هو الشيء نفسه الذي يخرج من جزيء الفيروس (بروتين S) ، والذي تتوج به هذه الفيروسات:

بمساعدة هذه البروتينات يتمسك الفيريون بمستقبل الخلية الضحية (ACE2 في حالتنا) ، ثم يخترق الداخل. لذلك ، يمكننا أن نقول أن هذا هو أهم جزء من الفيروس ، لأنه يحدد الحيوانات التي يمكن أن تؤثر وأيها لا يؤثر - مستقبلات ACE2 في الأنواع المختلفة مختلفة قليلاً من الناحية الهيكلية. في نفس الوقت ، من أصل جينوم 30 كيلوباس الضخم بأكمله وفقًا للمعايير الفيروسية ، فإن جين هذا البروتين هو 12-13 ٪ فقط ، أي حوالي 1300 حمض أميني. هذه هي الطريقة التي يتم بها بناء بروتين السنبلة في CoV2 وأقاربه المقربين:

كما يتضح من الشكل أعلاه ، يتكون بروتين S من وحدتين فرعيتين: S1 و S2. هو S1 الذي يتفاعل مع مستقبلات ACE2 ، والمكان الذي يتواجد فيه يسمى مجال ربط المستقبلات (RBD) ، ومنطقة الاتصال المباشر ، قدس الأقداس ، تسمى حافز تجليد المستقبل (RBM). هنا توضيح جميل من عمل جميل بنفس القدر :

RBD CoV2, ACE2.
() 2019-nCov. NTD, N- . RBD, - . RBM, - . SD1, 1. SD2, 2. FP, . HR1, 1. HR2, 2. TM, . IC, .
() RBD 2019-nCov. RBM .
() RBD 2019-nCov, ACE2. ACE2 . RBD 2019-nCoV , RBM — . RBD 2019-nCov . N- ACE2, , .
Overall structure of 2019-nCoV RBD bound with ACE2.
(a) Overall topology of 2019-nCoV spike monomer. NTD, N-terminal domain. RBD, receptor-binding domain. RBM, receptor-binding motif. SD1, subdomain 1. SD2, subdomain 2. FP, fusion peptide. HR1, heptad repeat 1. HR2, heptad repeat 2. TM, transmembrane region. IC, intracellular domain.
(b) Sequence and secondary structures of 2019-nCoV RBD. The RBM is colored red.
() Overall structure of 2019-nCoV RBD bound with ACE2. ACE2 is colored green. 2019-nCoV RBD core is colored cyan and RBM is colored red. Disulfide bonds in the 2019-nCoV RBD are shown as stick and indicated by yellow arrows. The N-terminal helix of ACE2 responsible for binding is labeled.

حتى هنا. عندما تم فك تشفير جينوم CoV2 فقط ، لم تكن تعرف في البداية سلالات مرتبطة به مباشرة. ولكن بالفعل في 23 يناير 2020 ، أصدرت شي زنغلي عملًا أعلنت فيه أن CoV2 يتزامن بنسبة 96 ٪ مع سلالة RaTG13 ، التي عزلها مختبرها في عام 2013 عن خفافيش يونان. صحيح ، خارج مختبرها حتى يناير 2020 ، لم يكن أحد يعرف عن هذه السلالة.

كان من الواضح على الفور أن RaTG13 هو صبي خاص. نلقي نظرة على الرسم البياني:

هذا رسم بياني لتشابه CoV2 مع سلالات أخرى معروفة. كلما ارتفع المنحنى ، زادت النسبة المئوية لمطابقة النوكليوتيدات. كما ترون ، في منطقة جين البروتين الشائك جدًا (S) ، فإن RaTG13 فقط هو أقرب أو أقل من CoV2 ، وجميع السلالات الأخرى في هذا المكان تذهب إلى الذروة - كلا سلالات الفيروس من الخفافيش الأخرى وأول سارس - CoV (منحنى أحمر ) ولكن حتى الآن لا يوجد شيء مريب - هل هناك أي سلالات غير معروفة من كهوف يونان لا تزال تحتوي على سلالات غير معروفة من العلم؟ حسنًا ، نعم ، ليس من الواضح كيف وصل الفيروس بالضبط إلى ووهان من هناك ، ولكن ما الذي لم يحدث.

بانجولينز

ثم ظهر البنغوليين في المشهد: في فبراير ، اكتشفت مجموعة أخرى من العلماء الصينيين في سلالهم سلالة من فيروس كورونا ، والتي ، على الرغم من أنها أسوأ بشكل عام من RaTG13 ، كانت مشابهة لـ CoV2 (90 ٪) ، من حيث أن بروتين ارتفاع RBM كان متطابقًا تقريبًا - كان مختلفًا فقط للحمض الأميني 1 (انظر التسلسلين العلويين ، تعني النقاط تزامنًا مع التسلسل الأول):

علاوة على ذلك ، في الربع الأول من بروتين S ، لا تتشابه سلالة البانجولينيوم مع CoV2 ، ويتزامن التسلسل بعد RBM في جميع السلالات الثلاثة (CoV2 ، Pangolin ، RaTG13) أكثر أو أقل. لكن RBM الخاص بـ RaTG13 يختلف تمامًا عن CoV2 ، والذي يمكن رؤيته من الانحدار الحاد للرسم البياني RaTG13 الأخضر مقارنة بالرسم البياني CoV2 الأحمر في منطقة RBM (الشريط الرأسي الوردي) في الرسم البياني التالي:

تم تأكيد هذا الاختلاف أيضًا من خلال التحليل الوراثي للسلالات لهذه المناطق الثلاثة الموضحة في الرسم البياني أعلاه - وفقًا لـ RBM ، فإن سلالة البنجولين أقرب إلى CoV2 من RaTG13 ، ولكن على اليسار واليمين من RBM إلى CoV2 فهي أقرب إلى RaVG13. أي أن هناك إعادة تركيب واضحة ، كما يذكر المؤلفون أنفسهم وبعض الأعمال الأخرى.

بالمناسبة ، من أين جاء البانجولين من الباحثين؟ ومن هنا:

وقد صادرتهم الجمارك الصينية من المهربين ونُقلوا إلى مركز لإعادة التأهيل في قوانغدونغ ، حيث ماتوا بأعراض فيروسات التاجية الحادة. هذا ، بالطبع ، لا يمكن إلا أن يثير اهتمام علماء الفيروسات المحليين ، الذين عزلوا عنهم مواد بيولوجية مختلفة:

, , - 2019 . (Manis pentadactyla) 25 (Manis javanica). ; , , . , , , , , , .
Pangolins used in the study were confiscated by Customs and Department of Forestry of Guangdong Province in March-December 2019. They include four Chinese pangolins (Manis pentadactyla) and 25 Malayan pangolins (Manis javanica). These animals were sent to the wildlife rescue center, and were mostly inactive and sobbing, and eventually died in custody despite exhausting rescue efforts. Tissue samples were taken from the lung, lymph nodes, liver, spleen, muscle, kidney, and other tissues from pangolins that had just died for histopathological and virological examinations.

بالمناسبة ، وليس فقط محليًا ، لأن باحثين صينيين آخرين (هونج كونج في هذه الحالة) تلقوا أيضًا عينات من بانجولين مصادر وفي فبراير 2020 أصدروا أيضًا عملًا مشابهًا ، مشيرين إلى علامات واضحة على إعادة التركيب في بروتين سبايك CoV2:

تلقينا عينات من الأنسجة المجمدة (الرئتين والأمعاء والدم) التي تم أخذها من 18 بانجولي مالاي ( Manis javanica ) خلال أغسطس 2017 - يناير 2018. تم الحصول على هذه البنغولانات خلال عمليات مكافحة التهريب من قبل جمارك قوانغشي. من المدهش أن تسلسل RNA عالي الأداء كشف عن وجود فيروسات كورونية في ستة (رئتين ، أمعاء ، مزيج واحد من الرئتين والأمعاء ، دم واحد) من 43 عينة.
...
, , , RaTG13 2019-CoV2 (. 1c, d). , 2019-CoV2 - (RBD; 97,4%; . 1c . 2a), 2019-CoV2 RaTG13. RaTG13 2019-CoV2 89,2% RBD. 2019-CoV2 RBD, RaTG13 2019-CoV2 ( 442, SARS-CoV ).
We received frozen tissue (lungs, intestine, blood) samples that were collected from 18 Malayan pangolins (Manis javanica) during August 2017-January 2018. These pangolins were obtained during the anti-smuggling operations by Guangxi Customs. Strikingly, high-throughput sequencing of their RNA revealed the presence of coronaviruses in six (two lung, two intestine, one lung-intestine mix, one blood) of 43 samples. With the sequence read data, and by filling gaps with amplicon sequencing, we were able to obtain six full or nearly full genome sequences — denoted GX/P1E, GX/P2V, GX/P3B, GX/P4L, GX/P5E and GX/P5L — that fall into the 2019-CoV2 lineage (within the genus Betacoronavirus) in a phylogenetic analysis (Figure 1a).
…
More notable, however, was the observation of putative recombination signals between the pangolins coronaviruses, bat coronaviruses RaTG13, and human 2019-CoV2 (Figure 1c, d). In particular, 2019-CoV2 exhibits very high sequence similarity to the Guangdong pangolin coronaviruses in the receptor-binding domain (RBD; 97.4% amino acid similarity; indicated by red arrow in Figure 1c and Figure 2a), even though it is most closely related to bat coronavirus RaTG13 in the remainder of the viral genome. Bat CoV RaTG and the human 2019-CoV2 have only 89.2% amino acid similarity in RBD. Indeed, the Guangdong pangolin coronaviruses and 2019-CoV2 possess identical amino acids at the five critical residues of the RBD, whereas RaTG13 only shares one amino acid with 2019-CoV2 (residue 442, human SARS-CoV numbering).

بالمناسبة ، سلط مؤلفو هذه المقالة الضوء أيضًا على الفسيفساء الوراثية النشيطة لبروتين سبايك CoV2:

ومن المثير للاهتمام ، أن التحليل الوراثي للمواقع المترادفة فقط في RBD أظهر أن الوضع الوراثي ل pangolin guangdong متوافق مع بقية الجينوم الفيروسي ، أي أنه ليس الأقرب من 2019-CoV2 (الشكل 2 ب). لذلك ، من الممكن أن يكون تشابه الأحماض الأمينية في RBD من فيروسات التاجية للبانغولين و 2019-CoV2 بسبب التطور المتقارب بوساطة انتقائية بدلاً من إعادة التركيب ، على الرغم من صعوبة الاختيار بين هذه السيناريوهات بناءً على البيانات المتاحة.
النص المصدر
Interestingly, a phylogenetic analysis of synonymous sites alone in the RBD revealed that the phylogenetic position of the Guangdong pangolin is consistent with that in the remainder of the viral genome, rather than being the closest relative of 2019-CoV2 (Figure 2b). Hence, it is possible that the amino acid similarity between the RBD of the Guangdong pangolin coronaviruses and 2019-CoV2 is due to selectively-mediated convergent evolution rather than recombination, although it is difficult to choose between these scenarios on current data.

تترجم كلمات المؤلفين من الناحية العلمية إلى أنه إذا قمنا بتحليل RBD الكامل للسلالات الثلاثة ، متجاهلين الاختلافات الواضحة (البدائل غير المترادفة) بينها ، والتي تعزى بشكل أساسي إلى RB M (والتي ، على ما أذكر ، متطابقة بين CoV2 و Pangolin) ، وقمنا ببناء شجرة النشوء عن طريق بدائل مترادفة ، ومع ذلك فإن CoV2 أقرب إلى RaTG13 ، وليس إلى سلالة بانجولين. وهو أمر غريب نوعًا ما في ضوء حقيقة أن pangoliniy مع CoV2 له RBM متطابق (أي جزء داخل RBD).

يفترض المؤلفون أيضًا أن هذا قد يكون ناتجًا عن تطور متقارب ، بمعنى آخر ، أن سلالات CoV2 و pangolins وصلت إلى RBM متطابقة لكل منها بطريقتها الخاصة ، وليس من خلال إعادة التركيب المشترك للأسلاف المشتركة. لأنه كان من الغريب حقًا أن يحدث إعادة التركيب - كما لو أن شخصًا ما أخذ للتو قطعة من RBM من سلالة بانجولين واستبدلها بـ RBM في RaTG13. وهذا ليس مثل التطور ، ولكن ، سامح داروين ، التصميم الذكي.

علم الأنساب للأشخاص المتوجين

لفهم أصل CoV2 بشكل أفضل ، دعنا نلقي نظرة أخرى على تسلسل بروتين السنبلة في ثالوثنا: CoV2 و RaTG13 و pangolin - قارن الفرق الثنائي بينهما (يتم تمييز الأحماض الأمينية المتطابقة بنقاط ، وتشير الأحرف الحمراء إلى الفرق ، وتشير الشرطات إلى الاختلاف / الأحماض الأمينية المحذوفة) :

يمكن أن نرى بالعين المجردة أنه في الربع الأول من التسلسل ، فإن سلالة البانجولينيوم بعيدة عن CoV2 و RaTG13. حسنًا ، إن RaTG13 ، إن لم يكن للمؤامرة في منطقة RBM (مستطيل أحمر) ، سيكون قريبًا جدًا من CoV2. ولكن ، كما قلت بالفعل ، فإن الموقع نفسه في CoV2 هو الأقرب إلى سلالة البنغولين.

بالمناسبة ، ماذا عن سلالات بانجولين أخرى؟ دعنا نلقي نظرة. بعد كل شيء ، قمنا حتى الآن فقط بتحليل الفيروس المعزول من البنجولين الذي صادرته الجمارك في عام 2019. كما تم مصادرة دفعة من البنجولين في عام 2017 ، وكان لديهم أيضًا سلالة مماثلة معزولة. إذا قارنا RaTG13 بجينوم الفيروسات من البنجولين لعامي 2017 و 2019 ، فإن كل شيء مثير للاهتمام هنا أيضًا:

في الربع الأول من بروتين S ، كانت سلالات البانجولين من 2017 أقرب إلى RaTG13 (و CoV2) من نظيرتها من البانجولين من 2019 (MP789). في الوقت نفسه ، لدى الثلاثة جميعهم سلف مشترك واضح حديثًا في المناطق التي أبرزتها المستطيلات الخضراء ، وفي هذه المناطق RaTG13 و pangolin-19 (MP789) أقرب إليه من pangolin-17 ، نظرًا لوجود العديد من الطفرات الشائعة مع RaTG13 (محاطة بدائرة حمراء وعلامات الحذف الزرقاء) ، التي لم تتم ملاحظتها في الأسطورة 17. في نفس الوقت ، فإن RBM لجميع الثلاثة مختلفة ومختلفة في نفس النسبة تقريبًا ، وفي أماكن مماثلة.

ربما ، حتى بعد انفصال أسلاف RaTG13 و MP789 ، استبدل MP789 جزءًا كبيرًا في الربع الأول من بروتين S (الذي لم يحدث في RaTG13 و pangolin-17) ، وبقي بروتين S شائعًا لجميع الثلاثة. ثم اجتمعت مسارات مجموعتي الجينات RaTG13 و MP789 مرة أخرى وفي نوبة من العاطفة ولدت CoV2. من الممكن أيضًا أن يكون سلف RaTG13 ناتجًا عن إعادة تركيب أسلاف سلالات البنجولين.

من المثير للاهتمام أيضًا رؤية الطفرة المتطابقة الفريدة إلى حد ما (QTQTNS) في RaTG13 و pangolin-19 أمام المكان الذي يحتوي CoV2 فيه على موقع جديد للانشطار الفروي ، والذي نشأ بسبب إدخال 4 أحماض أمينية جديدة في هذا المكان (PRRA). إذا نظرت إلى تسلسل النيوكليوتيد حول هذه الطفرة نفسها ، يمكنك أن ترى أن RaTG13 و CoV2 أقرب إلى بعضهما من pangolin-19 ، حيث تمكنا من تجميع عدة طفرات شائعة (مظللة باللون الأزرق):

بالمناسبة ، مع Orf1ab ، يحتوي CoV2 أيضًا على قفزة تطور جيني: 1a أقرب إلى RaTG13 ، ولكن 1b أقرب إلى pangolin-19:

أي ، اتضح أن سلف CoV2 أخطأ مع سلف مشترك من بانجولين 19 ، على الأقل مرتين؟ لأول مرة - عندما ورث (مع سلف مشترك مع RaTG13) Orf1ab والجزء الثاني من البروتين الشبيه بالطفرة مع طفرة QTQTNS ، وثانيًا - عندما حصل على 1b مع RBM ، والذي يختلف بالفعل عن RaTG13-s. لا ، بالطبع ، هذا ممكن وفي حد ذاته ليس جديرًا بالملاحظة بشكل خاص - بعد كل شيء ، تتحول هذه الفيروسات وتتحول باستمرار. سؤال آخر هو أين بالضبط يمكن العثور على الخفافيش وفيروسات البنغول مع بعضها البعض لمثل هذه العربدة - في الكهوف الجبلية ، "الأسواق الرطبة" ، ملاجئ الحيوانات المصادرة ، أو حتى في المختبرات. ولكن دعونا نتوقف لحظة مع هذه الأسئلة. أولاً ، ضع في اعتبارك الجانب الأكثر لفتًا للانتباه من الفيروس الجديد - الشريط الجانبي المكون من 4 أحماض أمينية والذي حوله إلى قاتل فائق.

أنا أضرب بترتيب ، لكن بصعوبة

من المستحيل تمامًا تجاهل مربع PRRA بين S1 و S2. وبصفته منشقًا ، يبرز في جينوم CoV2 الجديد. هذا الصندوق ليس بسيطًا ، ولكنه ذهبي. قامت بإنشاء موقع انقسام الفرو ، والذي ذكرته في البداية. أي نوع من الوحش هذا؟ سأحاول أن أشرح بإيجاز. تذكر هيكل بروتين سبايك لدينا؟ هنا رسم تخطيطي مرئي:

يتكون البروتين من جزأين ، S1 و S2 ، حيث يكون S1 مسؤولاً عن الاتصال الأساسي بالمستقبل (نفس نطاق ربط المستقبل / الحافز) ، و S2 مسؤول عن الاندماج مع غشاء الخلية واختراق الخلية. تبدأ عملية الاندماج المميزة بببتيد الاندماج الأصفر ، ولكن من أجل أن تبدأ أعمالها القذرة ، يجب على شخص قطع بروتين S في أحد المواقع التي أبرزتها المعينات في الرسم البياني أعلاه. ليس للفيروس "قواطع" خاصة به (هناك آخرون، لكن هذا غير ذي صلة) ، لذلك فهو يعتمد على البروتياز المختلفة لضحاياه ، الاستفادة من هذه البروتياز ، كما يمكنك فهمها من خلال وفرة ألوان تلك المعينات نفسها ، هناك عدة أنواع. لكن ليس كلهم متساوون ، وليس جميع أنواع الخلايا لديها البروتياز الذي يحتاجه الفيروس. والفيورين هو واحد من أكثرها فاعلية ، وحتى أنه يعيش ليس فقط على سطح الخلايا ، ولكن أيضًا في الداخل. من الواضح أن خطر موقع الفوران الجديد يتجلى في الاختلاف بين CoV2 و SARS-CoV "المتقدم":

كما يتضح من الرسم البياني ، في حالة CoV2 ، بفضل موقع Furin ، فهو ليس فئتين ، ولكن ثلاث فئات من البروتياز (ثلاثة بكمن متعدد الألوان) يمكنها قطع بروتين S الخاص بها خارج الخلية. ولكن ربما يكون الاختلاف الأكثر أهمية هو أن الفورين موجود أيضًا داخل الخلية ، لذلك يمكنه قطع بروتين S فورًا بعد تجميع الفيروس ، وبالتالي زيادة قدرة الفيروسات الجديدة على الاندماج مع خلايا أخرى - دون مغادرة شباك التذاكر ، إذا جاز التعبير.

بالمناسبة ، من المحتمل أن موقع الفوران الجديد يلعب دورًا مهمًا في المراضة والوفيات المعتمدة على العمر لـ CoV2:

, , , , , SARS-CoV-2. () COVID-19 . SARS-CoV-2 , .
Patients with hypertension, diabetes, coronary heart disease, cerebrovascular illness, chronic obstructive pulmonary disease, and kidney dysfunction have worse clinical outcomes when infected with SARS-CoV-2, for unknown reasons. The purpose of this review is to summarize the evidence for the existence of elevated plasmin(ogen) in COVID-19 patients with these comorbid conditions. Plasmin, and other proteases, may cleave a newly inserted furin site in the S protein of SARS-CoV-2, extracellularly, which increases its infectivity and virulence.

أوه نعم ، يقطع بروتينات Furin في أماكن محددة بدقة ، وبالتحديد بعد تسلسل RxxR (أي ، Arg-XX-Arg ، حيث يمكن أن يكون X أي حمض أميني). علاوة على ذلك ، إذا كان الأرجينين أيضًا في المركز الثاني أو الثالث (أي RRxR أو RxRR) ، فإن كفاءة الانقسام لهذا الموقع تزداد بشكل ملحوظ.

لذلك ، لوحظ على الفور ظهور موقع جديد للانقسام الفرني من قبل المتخصصين . لا يزال! بعد كل شيء ، ليس لدى أي من الأقرباء أو حتى البعيدين لـ Cov2 مثل هذا الموقع - تلك الفيروسات التاجية التي لديها 40 ٪ فقط قريبة من Cov2 من حيث الجينوم:

تم العثور على أن جميع بروتينات السنبلة مع تجانس البروتين SARS-CoV-2 أكبر من 40 ٪ لم يكن لها موقع انقسام فورني (الشكل 1 ، الجدول 1) ، بما في ذلك Bat-CoV RaTG13 و SARS-CoV (مع هوية التسلسل 97.4 ٪ و 78.6٪ على التوالي). موقع الفوران RRAR في SARS-CoV-2 فريد في عائلته بفضل إدراج PRRA الفريد. بالكاد يمكن أن يكون هذا الموقع في SARS-CoV-2 قد تطور من MERS ، HCoV-HKU1 ، إلخ. من التسلسلات المتاحة حاليًا في قواعد البيانات ، يصعب علينا العثور على المصدر. ربما هناك العديد من المتواليات الوسيطة التطورية التي تنتظر الاكتشاف.
النص المصدر
It was found that all Spike with a SARS-CoV-2 Spike sequence homology greater than 40% did not have a furin cleavage site (Figure 1, Table 1), including Bat-CoV RaTG13 and SARS-CoV (with sequence identity as 97.4% and 78.6%, respectively). The furin cleavage site “RRAR” in SARS-CoV-2 is unique in its family, rendering by its unique insert of “PRRA”. The furin cleavage site of SARS-CoV-2 is unlikely to have evolved from MERS, HCoV-HKU1, and so on. From the currently available sequences in databases, it is difficult for us to find the source. Perhaps there are still many evolutionary intermediate sequences waiting to be discovered.

هنا رسم توضيحي من نفس المقالة مثل الاقتباس أعلاه (يتم تمييز الفيروسات التاجية مع موقع فيورين باللون الوردي ، وتظهر 3 سلالات Cov2 مختلفة في الساعة 10):

أقرب قريب لموقع الفوران هو سلالة HKU5 ، المعزولة من قبل فريق Shi Zhengli في 2014 في قوانغتشو من الخفافيش من جنس Pipistrellus (تمت إضافته إلى GenBank في 2018). لكنه قريب جدًا - تتزامن بروتيناتهم الشبيهة بالارتفاع بنسبة 36 ٪ فقط.

بشكل عام ، يتم الخلط بين العلماء. من أين جاءت هذه المادة المكونة من 12 نيوكليوتيد؟ هل يمكن أن يكون من صنع الإنسان؟ الى حد كبير. في الواقع ، تعامل علماء الفيروسات مع مثل هذه الإدخالات بشكل متكرر ، ومنذ العصور القديمة. على سبيل المثال ، أدخل الأمريكيون RRSRR في بروتين زيادة أول فيروس سارس في عام 2006 :

من أجل التحقيق في ما إذا كان الانقسام التحليلي للبروتين عند تسلسل بقايا الأحماض الأمينية الرئيسية يمكن أن يعزز نشاط اندماج الخلايا ، قمنا بتحوير بروتين SARS-CoV الشبيه بالسنابل لإنشاء موقع للتعرف على الفراء (RRSRR) في أحد مكانين.
النص المصدر
To investigate whether proteolytic cleavage at the basic amino acid residues, were it to occur, might facilitate cell–cell fusion activity, we mutated the wild-type SARS-CoV glycoprotein to construct a prototypic furin recognition site (RRSRR) at either position.

وأدخل اليابانيون مثل هذا الموقع (RRKR) في بروتين SARS-CoV في عام 2008 ، على الرغم من أنه مصب قليلاً:

في نفس العام 2008 ، قام زملائهم الهولنديون أيضًا بدراسة مواقع البروتياز هذه في SARS-CoV وقارنوها بالفيروس التاجي الفأري MHV ، الذي يحتوي على هذا الموقع (SRRAHR | SV) ، علاوة على ذلك ، على غرار موقع CoV2 (SPRRAR | SV):

في عام 2009 ، قررت مجموعة أمريكية أخرى أيضًا ممارسة "تحسين" SARS-CoV ، ودون تغيير التقليد الأمريكي بعدم التلاعب بالأرجينين ، أدخلوا RRSRR :

للتحقيق في الاستخدام المحتمل لمواقع SARS-CoV S1-S2 و S2 كمواقع للانشقاق التحليلي للبروتين ، قدمنا أولاً مواقع التعرف على انقسام الفيران في هذه المواقع من خلال جعل الطفرات التالية 664-SLLRSTSQSI - SLL RRSRR SI-671 (S1-S2) و 792-LKPTKRSF-LKRTKRSF-799 (S2 ').
النص المصدر
To examine the potential use of the SARS-CoV S1–S2 and S2? positions as sites for proteolytic cleavage, we first introduced furin cleavage recognition sites at these locations by making the following mutations 664-SLLRSTSQSI — SLLRRSRRSI-671 (S1–S2) and 792-LKPTKRSF — LKRTKRSF-799 (S2?).

بكين 2019

لكن أحدث عمل مشابه رأيته كان عمل أكتوبر 2019 من قبل علماء من بكين ، حيث تم إدخال موقع الفوران الجديد RRKR ليس في بعض الفيروسات الكاذبة ، ولكن في فيروس التاج الحقيقي للدجاج ، فيروس التهاب الشعب الهوائية المعدي (IBV):

بالمناسبة ، من المثير للاهتمام أن نذكر المؤلفين أن إضافة موقع فيورين يسمح للفيروس المتحول بإصابة الخلايا العصبية. ربما يكون موقع Furin CoV2 هو الذي يجعل بعض المرضى الذين يعانون من CoV2 يظهرون أعراض عصبية ، بما في ذلك فقدان الرائحة:

S2' QX , , IBV (WT-IBV). , IBV S2 ( -S2) . IBV .
…
, , FP CoV, , , -, , .
Mutation of the S2' site of QX genotype (QX-type) spike protein (S) in a recombinant virus background results in higher pathogenicity, pronounced neural symptoms and neurotropism when compared with conditions in wild-type IBV (WT-IBV) infected chickens. In this study, we present evidence suggesting that recombinant IBV with a mutant S2' site (furin-S2' site) leads to higher mortality. Infection with mutant IBV induces severe encephalitis and breaks the blood–brain barrier.
…
In summary, our results demonstrate that the furin cleavage site upstream of the FP in S protein is an important site for CoV, modulating entry, cell–virus fusion, adaptation to its host cell, cell tropism and pathogenicity, but not antigenicity.

علاوة على ذلك ، فإن العديد من الفيروسات التاجية لها مواقع فورانية ، بالطبع ، موجودة في الطبيعة ، وهي متنوعة للغاية. نعم ، ويمكن أن تظهر نتيجة طفرات عشوائية. هذا هو بالضبط ما حدث في حالة متلازمة الشرق الأوسط التنفسية ، التي أبلغنا بها عام 2015 فريق دولي من المؤلفين ، من بينهم شي زينغلي ورالف باريك ، نجمان لعلم الفيروسات التاجية الاصطناعية. سنتذكرها أكثر من مرة ، ولكن في الوقت الحالي بضع كلمات حول هذه المقالة. في الواقع ، أظهر المؤلفان طفرتين رئيسيتين سمحت لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية بالقفز من الخفافيش إلى البشر. وأدت إحدى هذه الطفرات إلى ظهور موقع فيرين. صحيح ، لم يكن هذا صندوقًا من الأحماض الأمينية الجديدة ، ولكن طفرات الأحماض الموجودة سابقًا (الموضحة باللون الأحمر أدناه):

لم يظهر المؤلفون فقط ، ولكن أرفقوا هذه الطفرات مرة أخرى ببروتين سبايك الخفافيش الأصلي ، وخلقوا نفس الطفرات فيه (أي موقع الفرو) ، وأظهروا أن هذا يمنحها القدرة على إصابة الخلايا البشرية:

, HKU4 , HKU4, . , S746R N762A, HKU4.
…
, hPPC hECP HKU4 HKU4 . , HKU4 S1/S2, .
To evaluate the potential genetic changes required for HKU4 to infect human cells, we reengineered HKU4 spike, aiming to build its capacity to mediate viral entry into human cells. To this end, we introduced two single mutations, S746R and N762A, into HKU4 spike. The S746R mutation was expected to restore the hPPC motif in HKU4 spike, whereas the N762A mutation likely disrupted the potential N-linked glycosylation site in the hECP motif in HKU4 spike.
…
Therefore, the reengineered hPPC and hECP motifs enabled HKU4 spike to be activated by human endogenous proteases and thereby allowed HKU4 pseudoviruses to bypass the need for exogenous proteases to enter human cells. These results reveal that HKU4 spike needs only two single mutations at the S1/S2 boundary to gain the full capacity to mediate viral entry into human cells.

بالمناسبة ، كيف فعلوا ذلك يمكن أن يخيف الناس بعيدًا عن التكنولوجيا الحيوية الحديثة في حد ذاتها - لأن المؤلفين أدخلوا هذا البروتين الشبيه بفيروسات التاجية في الفيروس المعطل المعطل:

لفترة وجيزة ، تم الحصول على الفيروسات القهقرية ذات الشكل الزائف MERS-CoV التي تعبر عن جين مراسل luciferase عن طريق النقل المشترك لخلايا HEK293T مع بلازميد يحمل جين HIV-1 ، معيبًا Env معبرًا عن luciferase (pNL4-3.luc.RE-) وترميز البلازميد. -كوب البروتين المرتفع.
النص المصدر
Briefly, MERS-CoV-spike-pseudotyped retroviruses expressing a luciferase reporter gene were prepared by cotransfecting HEK293T cells with a plasmid carrying Env-defective, luciferase-expressing HIV-1 genome (pNL4–3.luc.R-E-) and a plasmid encoding MERS-CoV spike protein.

ربما هذا هو ما دفع الباحثين الهنود إلى البحث عن تسلسلات مماثلة في فيروس نقص المناعة البشرية و CoV2 في الجينوم (ولكن تم انتقاد طبعتهم بسرعة بسبب المنهجية الفاشلة والاستنتاجات الخاطئة). في الواقع ، يستخدم الخبراء مثل هذه الفيروسات الكاذبة بانتظام ، وبشكل عام ، لا ينبغي للمرء أن يكون غير مبالٍ بالخوف من الفيروسات القهقرية كطبقة - فقد تم استخدام فيروسات عدوانية من نوعها الفرعي في العلاج الجيني لسنوات عديدة.

من أين أتى RaTG13

بشكل عام ، RaTG13 هو سلالة استثنائية. من الغريب أنه طوال هذه السنوات ، كانت مجموعة شي Zhengli صامتة عنه. بعد كل شيء ، لا يشبه على الإطلاق إخوانه الآخرين ، خاصة في تسلسل البروتين الشبيه بالسمك ، وهذا ، على ما أذكر ، هو بالضبط المكان الذي يحدد أنواع الخلايا (والأنواع) التي يمكن لهذا الفيروس التمسك بها. فيما يلي رسم بياني لتشابه جينوم CoV2 مقارنة بالفيروسات التاجية الخفاش الأخرى (اللوحة B):

RaTG13 هو المنحنى الأحمر ، والأزرق هو السلالات الأقرب إلى RaTG13 (ZXC21 و ZC45). تم عزل هذه السلالات من الحدوات الصينية ( Rhinolophus sinicus ) في Zhoushan في عام 2015 ( ZXC21 ) و 2017 ( ZC45 ). كما يمكن رؤيته من الرسم البياني ، حتى أنها تختلف بشدة عن RaTG13 (المنحنى الأحمر) في منطقة بروتين S. في الوقت نفسه ، لا ينقل الرسم البياني أعلاه بشكل جيد مقياس الهاوية بينهما كمقارنة مباشرة للتسلسلات:

كما ترون ، فإن البروتينات الشبيهة بالأسنان ZXC21 و ZC45 ليست فقط بشكل عام 23-24 بقايا الأحماض الأمينية أقصر من بروتين RaTG13 ، ولكنها أقصر في المكان الأكثر أهمية - في RBM (انظر عمليات الحذف في المربع الأحمر المميز بشرطة حمراء).

إذن من أين أتت RaTG13؟ كما قلت ، في عام 2020 ، قالت شي Zhengli أنها عزلتها من خفافيش حدوة الحصان (فقط من النوع Rhinolophus affinis ، وليس R. sinicus ) في يوليو 2013 في يونان. صحيح ، حتى نهاية يناير 2020 ، لم يتم الإبلاغ عن وجودها علنًا ، ولكن كما تصف المجموعة شي Zhengli نفسها اكتشافها الكبير حول تشابهها مع CoV2 :

, - - (RdRp) (BatCoV RaTG13), Rhinolophus affinis , 2019-CoV2. ( GISAID EPI_ISL_402131). Simplot , 2019-CoV2 RaTG13 (Fig. 1c), 96,2%.
We then found that a short region of RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) from a bat coronavirus (BatCoV RaTG13) — which was previously detected in Rhinolophus affinis from Yunnan province — showed high sequence identity to 2019-CoV2. We carried out full-length sequencing on this RNA sample (GISAID accession number EPI_ISL_402131). Simplot analysis showed that 2019-CoV2 was highly similar throughout the genome to RaTG13 (Fig. 1c), with an overall genome sequence identity of 96.2%.

ليس سميكًا: حسنًا ، كانت لديهم هذه السلالة "المكتشفة سابقًا" ، وكانت كذلك. الاستلقاء على الرف. حتى عام 2020 ، تم تسلسل الجزء الوحيد من الجينوم المسؤول عن RdRp فيه. من أين أتى على الرف؟ في يونان في عام 2013 المخصصة. اين بالضبط؟ لم يقولوا. في GenBank أيضًا ، لم يكن لديك هذه المعلومات. ولكن لحسن الحظ ، كان هناك GISAID في قاعدة بيانات الجينوم: يقال أنه في مدينة بوير (نعم ، في وطن شاي الحبيب باستا) ، تم عزل ذكر من مسحة البراز:

هذا أثار اهتمامي قليلاً ، لأنه في رحلاتي حول Pabmed ، كنت قد تعثرت بالفعل في رحلة استكشافية إلى Puer في صيف 2013 :

تم القبض على الخفافيش في أماكن مختلفة في خمس مقاطعات من المحافظات الأربع في يونان ، الصين ، من مايو إلى يوليو 2013.
النص المصدر
Bats were captured from various locations in five counties of four prefectures of Yunnan Province, China, from May to July 2013.

لم يجد الباحثون شيئًا مثيرًا للاهتمام بشكل خاص بالنسبة لنا في هذه الرحلة ، ولكن ربما كان ذلك هو أن شي زنغلي (أو شخص من مجموعتها؟) حددت نفس عينة RaTG13؟ والتي قاموا بتسلسلها جزئيًا فقط ، ولكن لسبب ما قرروا عدم النشر ، على الرغم من أنها كانت مختلفة تمامًا عن كل شيء معروف سابقًا.

يمكن أن تشارك شي زينغلي بنفسها بشكل شخصي في هذه الرحلة ، لأنها تحدثت بحرارة عن مثل هذه الحملات - على سبيل المثال ، في أدائها الشبيه بـ TED في عام 2018 ، حيث عرضت صورها من هذه الحملات:

لقد كانت سلسلة من هذه الحملات التي جلبت شهرتها في جميع أنحاء العالم ولقبها "Batumen": في مقال عام 2013 في Nature ، أعلنت مجموعة Shi Zhengli بانتصار أنها اكتشفت في كهوف يونان خفافيش حاملة لسلالات RsSHC014 و Rs3367 التي تزامنت مع السارس الأول -كوب بنسبة 85٪ و 96٪ على التوالي.

بالمناسبة ، إنها مصادفة مضحكة أنه في نفس الوقت تقريبًا ، وفي نفس مقاطعة يوننان ، اتضح أن مجموعة Shi Zhengli أيضًا للعثور على سلالة RaTG13 ، والتي تبين أنها الأقرب إلى CoV2 ، وتتطابق جينوماتها أيضًا بنسبة 96٪.

ووهان -1

وبالعودة إلى هذا المقال المنتصر منذ عام 2013 ، قالت مجموعة شي زنغلي أيضًا إنه من خلال زراعة العينات المعزولة في ثقافة خلايا القرود فيرو ، تمكنوا من عزل فيروس حي كان مطابقًا تقريبًا لسلالة Rs3367 (الأقرب إلى سارس - CoV) . أطلق الباحثون على نسلهم WIV1 (حيث WIV اختصارًا لمعهد ووهان للفيروسات):

الأهم من ذلك ، نبلغ عن أول عزل للفيروس الحي SL-CoV (bat SL-CoV-WIV1) من عينات معزولة من براز الخفافيش في خلايا Vero E6 ، والتي لها مورفولوجيا نموذجية للفيروس التاجي ، هوية جينوم 99.9٪ Rs3367 ويستخدم الناس ACE2 ، عظام الزباد والحدوة لدخول الخلية. يظهر الاختبار الأولي في المختبر أن WIV1 لديها أيضًا أنواع استوائية واسعة النطاق.
النص المصدر
Most importantly, we report the first recorded isolation of a live SL-CoV (bat SL-CoV-WIV1) from bat faecal samples in Vero E6 cells, which has typical coronavirus morphology, 99.9% sequence identity to Rs3367 and uses ACE2 from humans, civets and Chinese horseshoe bats for cell entry. Preliminary in vitro testing indicates that WIV1 also has a broad species tropism.

دعونا نقارن RaTG13 مع سلالات Rs3367 و RsSHC014:

كما ترون ، فإن البروتين الشبيه بهذه السلالات ليس فقط أقصر من 13 من الأحماض الأمينية RaTG13-shn ، ولكنه يختلف أيضًا بشكل كبير في الربع الأول. بالمناسبة ، من الغريب أن تكون بروتينات السنبلة في Rs3367 (المعروف أيضًا باسم WIV1) و RsS0101 متطابقة تقريبًا ، وتختلف فقط في منطقة RBD (التسلسل الأيمن أدناه). تقريبًا مثل CoV2 و RaTG13 (بدون احتساب إدخال الفورين):

هل يمكن لأي باحث ، بعد أن تلقى عينات فيروسات تاجية من جمارك البنغولين المصادرة في مارس 2019 ، أن يرغب في التحقق من مدى استواء RBM pangolinium على مستقبل الإنسان؟ وماذا لو كان مع موقع Furin الأساسي في المكان الأكثر إثارة للاهتمام؟ ستكون هذه قنبلة!

من الناحية النظرية ، بالطبع ، يمكنه. لا يوجد شيء من الصعب تقنيًا على علماء الفيروسات إجراء مثل هذه التجارب. سؤال معقول: لماذا يستخدمون RaTG13 كأساس ، ولم يتم اختبار WIV1 بالفعل؟ ولكن من المحتمل أنهم اختبروا الوهم أيضًا مع WIV1. وبالتوازي مع ذلك ، قرروا محاكاة نوع إعادة تركيب فيروس البنجولين مع الخفافيش الأقرب إليه - بعد كل شيء ، فإن RaTG13 أقرب إلى سلالات البنجولين من WIV1: بروتينه الشبيه بالسنابل أقرب إليهما من الناحية الوراثية والهيكلية - حتى أنه يطابقها في الطول ، في حين أن البروتينات WIV1 / Rs3367 و RsSHC014 13 أحماض أمينية أقصر من البنغولين. ولا يمكن لطفرة QTQTNS الشائعة في RaTG13 و pangolin-19 (MP789) في منطقة موقع البروتياز أن تترك الاختصاص غير مبالٍ.

سلالات يونان الأخرى

بالمناسبة ، وجد باحثون آخرون في عام 2011 أيضًا عينات من الفيروسات التاجية من يونان رينولوفوس أفينيس ، وبدا أن السلالة LYRa11 هي الأكثر إثارة للاهتمام:

ولكنها أيضًا بعيدة جدًا عن RaTG13 ، وأقرب كثيرًا من Rs3367 (هذه السلالة التي تتزامن بنسبة 96 ٪ مع أول SARS-CoV):

لكن RaTG13 ، المعزول من نفس الخفافيش من Rhinolophus affinis مثل LYRa11 ، يبدو على الأقل مثلها (الانفجار الأيسر).

وأخيرًا ، سلالة أخرى من يونان (تدعى ببراعة يونان 2011) ، معزولة في عام 2011 عن نوع فرعي آخر من سباق حدوة الخيل ، Rhinolophus pusillus ، تشبه RaTG13 حتى أقل من LYRa11:

نعم ، وبينهما ، لا تعد Yunnan2011 و LYRa11 (الانفجار الصحيح أعلاه) متشابهين بشكل خاص ، بصرف النظر عن المنطقة المحفوظة بشدة S2. بالمناسبة ، أي نوع من الفوضى لديهم مع أسماء السلالات؟ أولاً ، يصفونه طوال العام ، وأحيانًا جزئيًا ، أو لا يصفونه على الإطلاق (Rs3367). يأتي أولاً نوع الناقل ( Ra TG13) ، ثم فيما بعد (LY Ra 11). هل ما زلت تتساءل ماذا يعني TG أو LY أو SHC؟ الأحرف الأولى لفك تشفير الجينوم؟

حسنًا ، دعنا ننتقل من علم الآثار الفيروسي إلى الهندسة الفيروسية ، أي زرع المناطق الرئيسية من بروتين السنبلة وتجارب كسب الوظيفة الأخرى (GOF).

1999: الفيروس التاجي الكيميائي الأول

إذا كنت تعتقد أن كل هذا المحرك GOF مع تحليل ما يسمح بالضبط للفيروسات التاجية للقفز من نوع إلى آخر بدأ استجابة لوباء السارس الأول في عام 2002 ، فأنت مخطئ. جرب علماء الفيروسات الفيروسات التاجية الكيميرية قبل ذلك بوقت طويل. هنا ، على سبيل المثال ، مقالة عينة من عام 1999 من مجموعة بيتر روتييه الهولندية من أوترخت مع القول "إعادة استهداف الفيروس التاجي عن طريق استبدال ectodomain في بروتين ارتفاع: عبور حاجز الأنواع":

باستخدام إعادة التركيب الموجه لل RNA ، قمنا ببناء متحولة من فيروس التهاب الكبد الفيروسي التاجي (MHV) ، حيث تم استبدال بروتين شائك ectodomain بواسطة ectodomain شديد الاختلاف من بروتين فيروس الصفاق المعدية. اكتسب الفيروس الخيمري الناتج ، fMHV المعين ، القدرة على إصابة خلايا القطط وفي نفس الوقت فقد القدرة على إصابة خلايا الفأر في الثقافة.
النص المصدر
Using targeted RNA recombination, we constructed a mutant of the coronavirus mouse hepatitis virus (MHV) in which the ectodomain of the spike glycoprotein (S) was replaced with the highly divergent ectodomain of the S protein of feline infectious peritonitis virus. The resulting chimeric virus, designated fMHV, acquired the ability to infect feline cells and simultaneously lost the ability to infect murine cells in tissue culture.

بالمناسبة ، يبدو أن شي Zhengli قد حصل على تدريب تحت قيادة بيتر روتييه في أوتريخت. في عام 2005 على الأقل ، شاركت في تأليف مقال مشترك حيث تم إدراج أوتريخت كمنتسب لها (ولكن تم ذكر العنوان الحالي بالفعل في معهد شنغهاي). بالمناسبة ، المقالة نفسها أيضًا غريبة للغاية - حيث بحث المؤلفون ما الذي يسمح للفيروسات بالضبط بتوسيع الأنواع الاستوائية:

يسمح عدد صغير فقط من الطفرات في بروتينه الشبيه بالطفرة للفيروس التاجي بالماوس بالتبديل من الاستوائية المحدودة للماوس إلى نطاق مضيف موسع عن طريق التخميل في المختبر. اكتسب أحد هذه الفيروسات التي درسناها موقعين ملتزمين لكبريتات الهيباران ، مع الحفاظ على موقع الفوران في مكان آخر.
النص المصدر
Only a relatively few mutations in its spike protein allow the murine coronavirus to switch from a murine-restricted tropism to an extended host range by being passaged in vitro. One such virus that we studied had acquired two putative heparan sulfate-binding sites while preserving another site in the furin-cleavage motif.

أولاً ، من المثير للاهتمام أن موقع الفوران في ذلك الفيروس (SRRAHR | SV) يشبه الموقع في CoV2 (SPRRAR | SV) ، على الرغم من أنه يقطع بشكل أكثر كفاءة في CoV2 بسبب وجود أرجينين مزدوج (وهذا يجعله موقعًا متعدد الأساس ، أي لديه العديد من الأحماض الأمينية الأساسية على التوالي في تسلسل RxxR ):

لكن المقالة غريبة بشكل خاص لأن الطفرات التي سمحت للفيروس "بتوسيع آفاقه" لم تحدث حتى في حيوانات المختبر ، ولكن في المختبر ( عن طريق المرور في المختبر ). ويبدو أنها حدثت بسرعة كبيرة:

MHV/pi23 — , 23 600 , MHV/BHK, HS- S1 , MHV/BHK, , HS- . MHV/pi23 , , MHV/BHK. HS- , , , S, HR1 (Fig. 1), . S, .
MHV/pi23, a virus obtained after 23 of the 600 passages that resulted in MHV/BHK, also contains a putative HS-binding site in the S1 domain at the same position as in MHV/BHK, albeit as a smaller insertion, while it lacks the putative HS-binding site immediately upstream of the fusion peptide. MHV/pi23 does infect nonmurine cells to some extent but much less efficiently than MHV/BHK. In addition to the multiple HS-binding sites, however, mutations found in other parts of the S protein, such as the HR1 domain and the putative fusion peptide (Fig. 1), might also contribute to the efficient entry into nonmurine cells. We are currently in the process of determining the S protein mutations that are required for the extended host range phenotype.

وبالنظر إلى المستقبل ، سأذكر أن هناك مجموعات أخرى حاولت طفرات في المختبر لزيادة فوعة الفيروس التاجي ، على سبيل المثال ، MERS:

من أجل فهم أفضل لقابلية التكيف لأنواع فيروس كورونا المسبب لمتلازمة الشرق الأوسط التنفسية ، استخدمنا متغير DPP4 دون الأمثل لدراسة التكيف الفيروسي. أدى مرور الفيروس على الخلايا التي تعبر عن متغير DPP4 هذا إلى تراكم الطفرات في بروتين ارتفاع الفيروس ، مما زاد من التكاثر.
النص المصدر
To better understand the species adaptability of MERS-CoV, we identified a suboptimal species-derived variant of DPP4 to study viral adaption. Passaging virus on cells expressing this DPP4 variant led to accumulation of mutations in the viral spike which increased replication.

علاوة على ذلك ، حدثت طفراتهم بالفعل بعد عدة مقاطع (جولات من تكاثر مزارع الخلايا):

(F) مخطط ظهور طفرات مفردة ومزدوجة في بروتين ارتفاع MERS-CoV في مقاطع مختلفة.
(ز) موقع الطفرات في بروتين ارتفاع MERS-CoV.
النص المصدر
(F) Schematic of single and double mutation emergence in MERS-CoV spike over different passages.
(G) Location of mutations within MERS-CoV spike.

لكن كل هذا سيكون بعد ذلك بكثير. في هذه الأثناء ، دعنا نعود إلى عام 2002 - قبل اندلاع أول سارس - CoV.

كيف أضاء بريق الطريق للجميع

رالف باريك أسطورة في علم الفيروسات التاجية. رائد حقيقي في تقنيات معالجة الجينوم الفيروسي الاصطناعي. في عام 2002 ، نشر عملًا مميزًا فتح معلماً جديداً في دراسة الآليات المختلفة للفيروسات الطبيعية وفي بحث كسب الوظيفة (GOF). في عملهم ، قامت مجموعة باريك بإعادة إنشاء نسخة من الفيروس التاجي للفأر الطبيعي بشكل اصطناعي:

II 59 (MHV-A59). , MHV 31,5 . , MHV-A59 ~ 31,5 ... , , , … , , .
النص المصدر
A novel method was developed to assemble a full-length infectious cDNA of the group II coronavirus mouse hepatitis virus strain A59 (MHV-A59). Seven contiguous cDNA clones that spanned the 31.5-kb MHV genome were isolated. The ends of the cDNAs were engineered with unique junctions and assembled with only the adjacent cDNA subclones, resulting in an intact MHV-A59 cDNA construct of ?31.5 kb in length. The interconnecting restriction site junctions that are located at the ends of each cDNA are systematically removed during the assembly of the complete full-length cDNA product, allowing reassembly without the introduction of nucleotide changes… The method has the potential to be used to construct viral, microbial, or eukaryotic genomes approaching several million base pairs in length and used to insert restriction sites at any given nucleotide in a microbial genome.

أي أن المؤلفين ، في الواقع ، قاموا بترجمة فيروس الحمض النووي الريبي إلى لغة الحمض النووي (باستخدام النسخ العكسي) ، بحيث يكون من المناسب لهم معالجة الجينوم الخاص به باستخدام أدوات الهندسة الوراثية الموجودة. بعد أن قاموا بإنشاء 7 أجزاء من فيروسات cDNA ، قام المؤلفون بعد ذلك بتجميعها معًا "بسلاسة" (دون ترك أي آثار) ، وبعد ذلك قاموا بنقل بنيتهم إلى الحمض النووي الريبي ، ثم تشكلت جزيئات الفيروس في خلايا أخرى.

السارس 2003

بعد أسابيع قليلة فقط من نشر هذا العمل من قبل مجموعة باريك ، ضرب وباء سارس - CoV ، ولم يضيع رالف باريك أي وقت. بالفعل في صيف 2003 ، أرسلت مجموعته لطباعة العمل على إنشاء استنساخ اصطناعي SARS-CoV:

, , SARS-CoV Urbani SARS ( SARS-CoV), , . , , … SARS-CoV , .
Using a panel of contiguous cDNAs that span the entire genome, we have assembled a full-length cDNA of the SARS-CoV Urbani strain, and have rescued molecularly cloned SARS viruses (infectious clone SARS-CoV) that contained the expected marker mutations inserted into the component clones. Recombinant viruses replicated as efficiently as WT virus and both were inhibited by treatment with the cysteine proteinase inhibitor… Availability of a SARS-CoV full-length cDNA provides a template for manipulation of the viral genome, allowing for the rapid and rational development and testing of candidate vaccines and therapeutics against this important human pathogen.

تسمح لنا سرعة مجموعة Barik بفهم مدى السرعة التي يمكن بها لفريق مؤهل من علماء الفيروسات إنشاء استنساخ اصطناعي من فيروس طبيعي ، وبالتالي إجراء تعديلات جينية عليه. وكان ذلك في عام 2003. اليوم يمكن تكرار كل المختبر المؤهل في غضون أسابيع.

السارس 2006

كان باريك الأول ، لكنه بعيد عن الأخير. تطورت الهندسة الوراثية بسرعة فائقة ، مما أدى إلى إنشاء المزيد والمزيد من الأدوات الجديدة. مارست مجموعات أخرى تقنيات الفيروسات الاصطناعية البديلة. على سبيل المثال ، في عام 2006 ، كرر الباحثون الإسبان إنجازات باريك ، وخلقوا أيضًا استنساخًا للسارس الاصطناعي ، ولكن باستخدام تقنية أخرى ( كروموسوم بكتيري صناعي ):

Urbani SARS-CoV (BAC). . , Escherichia coli.
…
SARS-CoV E.coli DH10B 200 , ( ). .
The engineering of a full-length infectious cDNA clone and a functional replicon of the severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) Urbani strain as bacterial artificial chromosomes (BACs) is described in this study. In this system, the viral RNA was expressed in the cell nucleus under the control of the cytomegalovirus promoter and further amplified in the cytoplasm by the viral replicase. Both the infectious clone and the replicon were fully stable in Escherichia coli.
…
The assembled SARS-CoV infectious cDNA clone was fully stable during its propagation in E. coli DH10B cells for more than 200 generations, considerably facilitating the genetic manipulation of the viral genome (data not shown). The detailed cloning strategy, plasmid maps, and sequences are available upon request.

صحيح أنهم لم يفعلوا ذلك بأناقة مثل باريك ، حيث أنهم في التجميع النهائي للفيروس الاصطناعي كانوا لا يزالون يضيفون مواقع إنزيمات التقييد ، بينما تعلم باريك الجمع بين الأجزاء "بسلاسة". ولكن هذه هي تفاهات ، فإن نهج الإسبان يعمل أيضًا تمامًا - في عام 2013 ، بمساعدتهم ، أنشأوا استنساخًا اصطناعيًا من MERS-a ، وفي عام 2015 ، تم تضمين تقنيتهم في دليل كتب الفيروسات التاجية (الفصل 13):

ووهان 2007

ولكن مرة أخرى في عام 2007. ثم انضمت مجموعة Shi Zhengli إلى سباق الفيروسات الاصطناعية بدراسة للبروتين الشبيه بالبروتينات لفيروسات التاجية البشرية والخفافيش ، محاولين تحديد ما هو المسؤول بالضبط عن القدرة على القفز من الأنواع إلى الأنواع:

تم إنشاء عدد من بروتينات السنبلة الخيمرية عن طريق إدخال العديد من سلاسل بروتين السكس السارس في العمود الفقري لبروتين SL-CoV.
النص المصدر
A series of S chimeras was constructed by inserting different sequences of the SARS-CoV S into the SL-CoV S backbone.

أي أن المؤلفين أدخلوا شرائح مختلفة من بروتين سارس - CoV البشري في بروتين فيروس الخفاش. هنا استنتاجهم:

من هذه النتائج ، وجد أن المنطقة من 310 إلى 518 في بروتين السنبلة BJ01 كانت ضرورية وكافية للحصول على بروتين السنبلة Rp3 القدرة على الارتباط بـ ACE2 البشري.
النص المصدر
From these results, it was deduced that the region from aa 310 to 518 of BJ01-S was necessary and sufficient to convert Rp3-S into a huACE2-binding molecule.

في الوقت نفسه ، حاولوا استبدال أجزاء أقصر ، بما في ذلك RBM فقط:

لإدخال RBM من SARS-CoV في بروتين سبايك SL-CoV ، تم استخدام منطقة الترميز من 424 إلى 494 من الأحماض الأمينية في بروتين السنبلة BJ01 لاستبدال المناطق المقابلة في بروتين Rp3 ، مما أدى إلى جين بروتين سبايك خيالي (CS) ، تم تعيينه باسم CS424 –494.
النص المصدر
For introduction of the RBM of SARS-CoV S into the SL-CoV S, the coding region from aa 424 to 494 of BJ01-S was used to replace the corresponding regions of Rp3-S, resulting in a chimeric S (CS) gene designated CS424–494.

بالنظر إلى أنه كتب في عام 2007 ، أعتقد أنه لن يكون من الصعب حتى على عالم الفيروسات المبتدئ استبدال RBM لفيروس آخر.

الوهم 2015

في ضوء التجارب المذكورة أعلاه ، ليس من الواضح ما الذي تسبب في الإحساس بالضبط الذي أنتجته أكثر المنشورات إثارة للوظيفة. هذا ، بالطبع ، عن العمل المشترك لشي زنغلي ورالف باريك ، حيث ابتكروا فيروسًا كيميائيًا اصطناعيًا:

SARS-CoV, , SHC014 SARS-CoV. , 2b, SHC014 , SARS (ACE2), in vitro, SARS-CoV. , in vivo . ; , CoV . SHC014 in vitro, in vivo.
النص المصدر
Using the SARS-CoV reverse genetics system, we generated and characterized a chimeric virus expressing the spike of bat coronavirus SHC014 in a mouse-adapted SARS-CoV backbone. The results indicate that group 2b viruses encoding the SHC014 spike in a wild-type backbone can efficiently use multiple orthologs of the SARS receptor human angiotensin converting enzyme II (ACE2), replicate efficiently in primary human airway cells and achieve in vitro titers equivalent to epidemic strains of SARS-CoV. Additionally, in vivo experiments demonstrate replication of the chimeric virus in mouse lung with notable pathogenesis. Evaluation of available SARS-based immune-therapeutic and prophylactic modalities revealed poor efficacy; both monoclonal antibody and vaccine approaches failed to neutralize and protect from infection with CoVs using the novel spike protein. On the basis of these findings, we synthetically re-derived an infectious full-length SHC014 recombinant virus and demonstrate robust viral replication both in vitro and in vivo.

هذا ، في الواقع ، كان الباحثون بالفعل على المسار الصحيح: أخذوا بروتينًا شبيهًا بالارتفاع من RsSHC014 ، الذي عزله شي زنغلي من خفافيش يونان في عام 2011 ، وأدخله في سارس - CoV ، تم تكييفه خصيصًا للفئران الزاحفة ، للتجارب اللاحقة في الجسم الحي على هذه الفئران. حسنًا ، تم اختبار تصميم جديد على الخلايا البشرية. وفي الوقت نفسه ، مارسنا إنشاء نسخة مستنسخة من نفس RsSHC014 - حسنًا ، لم لا؟ أولاً ، إنها جميلة:

(أ) مخطط الاستنساخ الجزيئي SHC014-CoV ، الذي تم تصنيعه في شكل ستة أجزاء متجاورة من cDNA (المعينة على أنها SHC014A و SHC014B و SHC014C و SHC014D و SHC014E و SHC014F) يحيط بها انزيم تقييد BglI الفريد لمواقع DNA التي تقدم مباشرة 1a، 1b، spike، 3، envelope، matrix، 6-8 and nucleocapsid). النيوكليوتيدات التي تحتها خط هي نتاجات بارزة تشكلت بعد تقييد هضم الإنزيم.
النص المصدر
(a) Schematic of the SHC014-CoV molecular clone, which was synthesized as six contiguous cDNAs (designated SHC014A, SHC014B, SHC014C, SHC014D, SHC014E and SHC014F) flanked by unique BglI sites that allowed for directed assembly of the full-length cDNA expressing open reading frames (for 1a, 1b, spike, 3, envelope, matrix, 6–8 and nucleocapsid). Underlined nucleotides represent the overhang sequences formed after restriction enzyme cleavage.

وثانيًا ، أدرك الباحثون أنه ليس فقط من خلال طبيعة لسان البروتين الشبيه بالارتفاع إلى المستقبل أن قدرة الفيروس على الانتقال من نوع حيواني إلى آخر - لأن خميرة SHC014-MA15 كانت أكثر ضراوة من SHC014 ، حتى في الخلايا البشرية:

من الجدير بالذكر أن مدار الرئة التفاضلي مقارنة بالسارس-MA15 وإضعاف SHC014-CoV كامل الطول في الثقافات [الجهاز التنفسي الظهاري البشري] نسبة إلى السارس- CoV Urbani تشير إلى أنه بالإضافة إلى الارتباط بـ ACE2 ، هناك عوامل أخرى - بما في ذلك إنتاجية بروتين السنبلة ، التوافر البيولوجي للمستقبل أو العداء للاستجابات المناعية للمضيف - قد يسهم في الضراوة.
النص المصدر
Notably, differential tropism in the lung as compared to that with SARS-MA15 and attenuation of full-length SHC014-CoV in [human epithelial airway cell] cultures relative to SARS-CoV Urbani suggest that factors beyond ACE2 binding — including spike processivity, receptor bio-availability or antagonism of the host immune responses — may contribute to emergence.

أرغب بشكل خاص في تحديد قابلية إنتاج بروتين السنبلة في الاقتباس ، لأن هذه ليست المرة الأولى التي يكتب فيها الباحثون أن قدرة بروتين السنبلة على شق البروتياز (بما في ذلك الفوران) لها تأثير كبير على الفوعة.

في الختام ، فإن الموضوع هو صورة مشتركة لرالف باريك وشي Zhengli. تم التقاط الصورة في ووهان في أكتوبر 2018:

فأرة السارس 2007

هنا لا يسعني إلا أن أذكر نوع "فيروس الماوس MA15" الذي كان عليه في عمل سابق. هذا ليس نوعًا من الفيروسات التاجية للفأر الطبيعي ، كما قد يقترح المرء. وهذا هو سارس - CoV البشري المعدل في المختبر ، والذي في عام 2007 ، تحولت مجموعة باريك نفسها - التي تنافس على ما يبدو مع مجموعة شي زينغلي (تذكر مقالهم من عام 2007) - إلى قاتل حقيقي . للقيام بذلك ، قاموا أولاً "بتحسين" التكرار على الفئران ، وعندما أصبحت بعد "التكرارات" "فعالة" إلى أقصى حد ، قاموا بإعادة إنتاج الطفرات التي نشأت في الفئران في الاستنساخ الاصطناعي لفيروس جديد ، وتحققوا مرة أخرى من أنه زاد بالفعل من العدوى:

SARS-CoV ( Urbani) BALB/c. (MA15), . , , , . , . , , 15, , . MA15 , ; SARS-CoV (rMA15), MA15. 15 , SARS .
We adapted the SARS-CoV (Urbani strain) by serial passage in the respiratory tract of young BALB/c mice. Fifteen passages resulted in a virus (MA15) that is lethal for mice following intranasal inoculation. Lethality is preceded by rapid and high titer viral replication in lungs, viremia, and dissemination of virus to extrapulmonary sites accompanied by lymphopenia, neutrophilia, and pathological changes in the lungs. Abundant viral antigen is extensively distributed in bronchial epithelial cells and alveolar pneumocytes, and necrotic cellular debris is present in airways and alveoli, with only mild and focal pneumonitis. These observations suggest that mice infected with MA15 die from an overwhelming viral infection with extensive, virally mediated destruction of pneumocytes and ciliated epithelial cells. The MA15 virus has six coding mutations associated with adaptation and increased virulence; when introduced into a recombinant SARS-CoV, these mutations result in a highly virulent and lethal virus (rMA15), duplicating the phenotype of the biologically derived MA15 virus. Intranasal inoculation with MA15 reproduces many aspects of disease seen in severe human cases of SARS.

-2008

يتحدث عن تنافس باريك وشي Zhengli. بالتوازي مع زرع RBD من السارس - CoV البشري إلى الفئران ، أنشأت مجموعته نفس الوهم مع سلالات الخفافيش. في عام 2008 ، أخذت مجموعة باريك سلالة Bat-SCoV واستبدلت بـ RBD في بروتين ارتفاع مع RBD من السارس البشري. هذا ، في الواقع ، كررت عمل شي Zhengli من عام 2007 ، ليس فقط اقتصرت نفسها على الفيروسات الزائفة ، ولكن خلق فيروس كورونا حقيقي - ليس مجرد فيروس مثل عمل عام 2015 ، ولكن أكثر البشر. كان المؤلفون فخورون بوضوح بإنجازاتهم:

, 29,7 — (Bat-SCoV), (SARS), SARS-CoV.
…
, RBDs Bat-SCoV SARS-CoV , RBD Bat-SCoV ( 323–505) RBD SARS-CoV ( 319–518) (27, 28) (GenBank FJ211860), , in vivo (Fig. 1B).
Here, we report the design, synthesis, and recovery of the largest synthetic replicating life form, a 29.7-kb bat severe acute respiratory syndrome (SARS)-like coronavirus (Bat-SCoV), a likely progenitor to the SARS-CoV epidemic.
…
To test whether the RBDs of Bat-SCoV and SARS-CoV were interchangeable, we replaced the Bat-SCoV RBD (amino acid 323–505) with the SARS-CoV RBD (amino acid 319–518) (27, 28) (GenBank accession no. FJ211860), simulating a theoretical recombination event that might occur during mixed infection in vivo (Fig. 1B).

(B) , SARS-CoV Bat-SCoV. . Bat-SRBD Bat-SCoV, , RBD Bat-SCoV ( Bat-SCoV 323–505) RBD SARS-CoV ( 319–518) ( GenBank FJ211860 ). Bat-SRBD-MA RBD MA15 SARS-CoV Y436H. Bat-SRBM 13 SARS-CoV, ACE2, RBD 323I-429T Bat-SCoV 426R-518D SARS-CoV. Bat-Hinge Bat-SRBM, Bat-SCoV 392L-397E SARS-CoV 388V-393D. Bat-F 1–24057 SARS-CoV ( 855 ) 3'- Bat-SCoV. 1- (P1). ND , .
النص المصدر
(B) Schematic representation showing organization of the SARS-CoV and Bat-SCoV Spike proteins. The engineered Spike proteins are pictured below with the virus name to the left. Bat-SRBD includes all of the Bat-SCoV Spike sequence except that the Bat-SCoV RBD (Bat-SCoV amino acid 323–505) is replaced with the SARS-CoV RBD (amino acid 319–518) (GenBank accession no. FJ211860). Bat-SRBD-MA includes the MA15 Spike RBD change at SARS-CoV aa Y436H. Bat-SRBM includes the minimal 13 SARS-CoV residues critical for ACE2 contact, resulting in a chimeric RBD of Bat-SCoV amino acid 323I-429T and SARS-CoV amino acid 426R-518D. Bat-Hinge is Bat-SRBM sequence, with Bat-SCoV amino acid 392L-397E replaced with SARS-CoV amino acid 388V-393D. Bat-F includes nt 1–24057 of SARS-CoV (to Spike amino acid 855), with the remaining 3? sequence from Bat-SCoV. To the right of the schematic representations, observation of transcript activity and approximate stock titers at passage 1 (P1) are indicated. ND indicates no infectious virus detected by plaque assay.

باريك 2016

في عمل باريك بشكل عام هناك العديد من عمليات إعادة التصميم. على سبيل المثال ، في عام 2016 ، وهو العام الذي كرر فيه نفس العمل تقريبًا مع شي تشزنلي بحلول عام 2015 لإنشاء فيروس خيمري ، ولكن هذه المرة وضع بروتين شوكي قطعة سهينوادابتيروفاني السارس ليس من RsSCH014 ، ومن آخر وجد شي تشيزنلي في يونان ذلك قريب قريب - 336 روبية. أو على وجه الدقة ، من سلالة WIV1 ، استنساخ مختبر Rs3367 نمت في زراعة الخلايا في معهد ووهان للفيروسات في عام 2013. هذا بالضبط ما فعلته مجموعة باريك في 2016:

SARS-CoV (7), WIV1-CoV, , , , (. S1A). WIV1-CoV, SARS WIV1 (WIV1-MA15, . S1B). … Vero SARS-CoV Urbani, WIV1-MA15 WIV1-CoV.
Using the SARS-CoV infectious clone as a template (7), we designed and synthesized a full-length infectious clone of WIV1-CoV consisting of six plasmids that could be enzymatically cut, ligated together, and electroporated into cells to rescue replication competent progeny virions (Fig. S1A). In addition to the full-length clone, we also produced WIV1-CoV chimeric virus that replaced the SARS spike with the WIV1 spike within the mouse-adapted backbone (WIV1-MA15, Fig. S1B). … To confirm growth kinetics and replication, Vero cells were infected with SARS-CoV Urbani, WIV1-MA15, and WIV1-CoV.

أي بشكل عام ، في عام 2016 ، استنساخ باريك مقالته من عام 2015. علاوة على ذلك ، فإن معناه ليس واضحًا بالنسبة لي: بعد كل شيء ، WIV1 / Rs3367 ، إذا كنت تتذكر ، تزامن بالفعل 96 ٪ مع SARS-CoV (لهذا شي Zhengli اكتسب شهرة). لذلك ، لماذا لا يكون واضحًا بالنسبة لي إدخال بروتين شبيه بالسباك من أقرب قريب له في SARS-CoV. ربما فقط من حب الفن. في ضوء ذلك ، يكتسب عنوان مقالته ازدواجية معينة: "WIV1-CoV الشبيه بالسارس جاهز للانتقال إلى البشر" . لسبب ما ، يتبادر إلى الذهن هذا الإطار على الفور:

ما زلت لا أفهم كيف تمكن باريك في عام 2015 من الحصول على براءة اختراع لإنشاء "بروتينات شبيهة بالفايروسات التاجية الكيميرية" ، مع الأخذ في الاعتبار حقيقة أنه هو وشي زينجلي نشر كل هذا قبل فترة طويلة من عام 2015.

باريك 1990

حسنًا ، اللمسة الأخيرة لصورة رالف باريك. لم يكن مجرد موقِّتًا قديمًا في هذا المجال ، ولكنه كان منخرطًا في تصميم الفيروسات التاجية المؤتلفة حتى قبل أي أجهزة تسلسل وأدوات حديثة أخرى في الهندسة الوراثية. هنا مقاله عن إنشاء "طفرات درجة الحرارة" من فيروس كورونا الفيروسي من عام 1990:

خلال هذه الدراسة ، تم استخدام سلالة فيروس التهاب الكبد الفأري A59 (MHV-A59). تم نشر الفيروس واستنساخه ثلاث مرات في خط خلية ورم نجمي مستمر (DBT).
...
كانت مختلطة مجموعات مختلفة من المسوخ حساسة للحرارة وتلقيح داخل الخلايا مع عدد وافر من العدوى يساوي 10.
النص المصدر
The A59 strain of mouse hepatitis virus (MHV-A59) was used throughout the course of this study. Virus was propagated and cloned three times in the continuous murine astrocytoma cell line (DBT).
…
Various combinations of ts mutants were mixed and inoculated onto cells at a multiplicity of infection of 10 each.

إذاً ، كان باريك يخلق طفرات فيروسية مختلفة لأكثر من 30 عامًا.

باريك 2019

وبالمناسبة ، حتى الآن ، لا تقل السرعة. في نهاية أكتوبر 2019 ، قدمت مجموعته للنشر مقالًا آخر حول الدور المهم لموقع الفوران في بروتين السنبلة للتغلب على "حاجز العدوى الحيوانية المنشأ" من قبل الفيروسات التاجية:

معًا ، تُظهر هذه النتائج أن انقسام البروتياز يمثل أيضًا حاجزًا رئيسيًا أمام إصابة خلايا فيرو بفيروس HKU5-CoV. بالنظر إلى أبعد من ذلك ، قمنا بمقارنة الانقسام المتوقع عند حدود S1 / S2 و S2 وموقع البروتياز السيستين في MERS و PDF 2180 و HKU5 بروتينات شبيهة بالارتفاع (الشكل 6 د) (26). في موقع S1 / S2 ، تحتفظ MERS وأوغندا و HKU5 بموقع انقسام RXXR ، على الرغم من أن الأحماض الأمينية الداخلية المختلفة قد تؤثر على فعاليته. بالنسبة إلى تسلسل S2 '، تحتفظ MERS و HKU5 أيضًا بزخرفة RXXR ؛ ومع ذلك ، فإن الأرجينين الأول (SNAR) غير موجود في المسامير من سلالة أوغندا ، مما قد يؤثر على الانقسام.
النص المصدر
Together, these results demonstrate that protease cleavage is also the primary barrier to infection of Vero cells with HKU5-CoV. Examining further, we compared the predicted cleavage at S1/S2 border, S2’, and the endosomal cysteine protease site across MERS, PDF2180, and HKU5 spikes (Fig. 6D) (26). For the S1/S2 site, MERS, Uganda, and HKU5 maintain the RXXR cleavage motif, although the different interior amino acids may alter efficiency. For the S2’ sequence, MERS and HKU5 also retain the RXXR motif; however, the Uganda spike lacks the first arginine (SNAR), potentially impacting cleavage.

وإدراكا للروح التنافسية بين مجموعتي باريك وشي زنغلي ، أتساءل ما هو احتمال قيام شخص في ووهان بنهاية عام 2019 بإجراء بحث مماثل؟

كسب الوظيفة: "الرفض لا يمكن أن يستمر"

يسأل الكثير ممن سمعوا عن الدراسات السابقة سؤالاً معقولاً: "ماذا بحق الجحيم؟" لماذا يصنع العلماء فيروسات قاتلة خيميرية؟ الجواب الصحيح سياسياً: تطوير الحماية الوقائية (اللقاحات والأدوية) من الخيميرات الطبيعية المحتملة وفهم مخاطر حدوثها. هنا ، في الواقع ، كتب باريك وشي زنغلي والمؤلفون المشاركون أنفسهم حول هذا الموضوع في نفس المقالة لعام 2015:

, (GOF). (Fig. 4a, b) , SHC014-MA15, , . SHC014-MA15 SARS-CoV, , CoV Urbani MA15, , . , Urbani-MA15 CoV, SHC014-MA15 (. 1). , , , . , . GOF; . , , , .
النص المصدر
In addition to offering preparation against future emerging viruses, this approach must be considered in the context of the US government–mandated pause on gain-of-function (GOF) studies. On the basis of previous models of emergence (Fig. 4a,b), the creation of chimeric viruses such as SHC014-MA15 was not expected to increase pathogenicity. Although SHC014-MA15 is attenuated relative to its parental mouse-adapted SARS-CoV, similar studies examining the pathogenicity of CoVs with the wild-type Urbani spike within the MA15 backbone showed no weight loss in mice and reduced viral replication. Thus, relative to the Urbani spike–MA15 CoV, SHC014-MA15 shows a gain in pathogenesis (Fig. 1). On the basis of these findings, scientific review panels may deem similar studies building chimeric viruses based on circulating strains too risky to pursue, as increased pathogenicity in mammalian models cannot be excluded. Coupled with restrictions on mouse-adapted strains and the development of monoclonal antibodies using escape mutants, research into CoV emergence and therapeutic efficacy may be severely limited moving forward. Together, these data and restrictions represent a crossroads of GOF research concerns; the potential to prepare for and mitigate future outbreaks must be weighed against the risk of creating more dangerous pathogens. In developing policies moving forward, it is important to consider the value of the data generated by these studies and whether these types of chimeric virus studies warrant further investigation versus the inherent risks involved.

هل كانت هذه الكلمات نبوية؟ في نهاية عام 2014 ، فرضت الولايات المتحدة وقفاً اختيارياً على تمويل الدولة لدراسات كسب الوظيفة هذه ، ولكن تم إلغاؤها على الفور تقريباً (في عام 2017) . وفي الصين ، لم يتم فرض أي حظر على مثل هذه الدراسات ، بل على العكس ، فتحوا "مختبرات فائقة (بدون) خطيرة" من مستوى BSL-4 ، كما في 2017 في ووهان :

في هذه الحالة فقط ، سأوضح أنه حتى عام 2017 ، كان المختبر في معهد ووهان للفيروسات BSL-3 ، وهو ما يكفي للعمل مع الفيروسات التاجية. فيما يلي بعض الاقتباسات من الملاحظة أعلاه حول إنشاء مختبر ووهان BSL-4:

— , , BSL-4, . ; , . « ».
…
. BSL-4 ; , , , .

, , BSL-4 — , , — . « , , », — .

BSL-4 . , , , , . , , .

« », — . , : « , , ».

يقول تريفان إن استثمار الصين في مختبر BSL-4 ، قبل كل شيء ، يمكن أن يكون وسيلة لإثبات للعالم أن البلاد قادرة على المنافسة. يقول: "هذا رمز مكانة كبيرة في علم الأحياء ، بغض النظر عما إذا كانت هناك حاجة إليها أم لا."
النص المصدر
Future plans include studying the pathogen that causes SARS, which also doesn’t require a BSL-4 lab, before moving on to Ebola and the West African Lassa virus, which do. Some one million Chinese people work in Africa; the country needs to be ready for any eventuality, says Yuan. “Viruses don’t know borders.”
…
The plan to expand into a network heightens such concerns. One BSL-4 lab in Harbin is already awaiting accreditation; the next two are expected to be in Beijing and Kunming, the latter focused on using monkey models to study disease.
Lina says that China’s size justifies this scale, and that the opportunity to combine BSL-4 research with an abundance of research monkeys — Chinese researchers face less red tape than those in the West when it comes to research on primates — could be powerful. “If you want to test vaccines or antivirals, you need a non-human primate model,” says Lina.
But Ebright is not convinced of the need for more than one BSL-4 lab in mainland China. He suspects that the expansion there is a reaction to the networks in the United States and Europe, which he says are also unwarranted. He adds that governments will assume that such excess capacity is for the potential development of bioweapons.
“These facilities are inherently dual use,” he says. The prospect of ramping up opportunities to inject monkeys with pathogens also worries, rather than excites, him: “They can run, they can scratch, they can bite.”
Trevan says China’s investment in a BSL-4 lab may, above all, be a way to prove to the world that the nation is competitive. “It is a big status symbol in biology,” he says, “whether it’s a need or not.”

ومن المثير للاهتمام ، بالإضافة إلى ووهان ، أنهم خططوا لفتح مختبر BSL-4 جديد في كونمينغ ، مع التركيز على اختبار اللقاحات على الرئيسيات. كونمينغ ، أذكركم ، هذه هي عاصمة يونان. في الكهوف المجاورة وجد شي Zhengli السلالات ذاتها Rs3367 و RsSHC014. بالمناسبة ، تم ذكر اختبار الأسبقية كخطوات إضافية محتملة لتطوير اللقاحات الوقائية ضد تفشي فيروسات تاجية محتملة في المستقبل "في نفس" (كم مرة سمتها ذلك؟) مقال باريك وشي Zhengli:

ومع ذلك ، يلزم إجراء المزيد من الاختبارات على الرئيسيات غير البشرية من أجل ترجمة هذه النتائج إلى إمكانات مسببة للأمراض في البشر. من المهم ملاحظة أن نقص العوامل العلاجية المتاحة يحدد الحاجة الماسة لمزيد من الدراسة وتطوير طرق العلاج. من خلال هذه المعرفة ، يمكن تطوير برامج المراقبة والكواشف التشخيصية والعلاجات الفعالة التي يمكن أن تحمي من ظهور الفيروسات التاجية الخاصة بالمجموعة 2 ب ، مثل SHC014 ، ويمكن تطبيقها على فروع فيروسات التاجية الأخرى التي تدعم تجمعات متجانسة مماثلة.
النص المصدر
However, further testing in nonhuman primates is required to translate these finding into pathogenic potential in humans. Importantly, the failure of available therapeutics defines a critical need for further study and for the development of treatments. With this knowledge, surveillance programs, diagnostic reagents and effective treatments can be produced that are protective against the emergence of group 2b–specific CoVs, such as SHC014, and these can be applied to other CoV branches that maintain similarly heterogeneous pools.

من المحتمل أنه بحلول عام 2019 ، كان إنشاء واختبار اللقاحات المحتملة من مختلف الفيروسات التاجية الشبيهة بالسارس على قدم وساق.

حول عدد الأوبئة المعجزة التي تعدها روح التنوير ...

حسنًا ، دعنا نلقي نظرة على إصدار تسرب المختبر. بادئ ذي بدء ، سأقدم خلفية تاريخية موجزة عن التسريبات الأخرى. لأن براعم الفيروسات من المختبرات حدثت في السابق أكثر من مرة. بادئ ذي بدء ، من نفس السارس - CoV: لأول مرة هرب في صيف 2003 في سنغافورة ، ثم في ديسمبر 2003 في تايوان ، وفي ربيع 2004 سافر مرتين إلى بكين.

كانت هناك مكالمات مزعجة في أوروبا والولايات المتحدة ، على الرغم من عدم وجود إصابات. على سبيل المثال ، في فرنسا ، فقد أحد المختبرات ، بطريقة ما ، أنابيب الاختبار مع السارس ، وفي مختبر BSL-4 الأمريكي في تكساس ، كانت أنابيب الاختبار المصابة بفيروس الحمى النزفية الفنزويلية مفقودة :

عمل عالم واحد فقط مع الفيروس ، وقال رييس إن المختبر يشتبه في أن العالم ألقى بطريق الخطأ أنبوب اختبار في نوفمبر.
...
يمتلك معهد جالفستون بيولابوراتوري أكثر الإجراءات الأمنية صرامة لأنه يدرس مواد السلامة البيولوجية BSL-4 ، أي الأمراض المعدية الخطيرة التي لا تحتوي على لقاحات أو أدوية. تشتمل مواد BSL-4 على غواناريتو وإيبولا والجدري.
النص المصدر
Only one scientist worked with the virus, and Reyes said the lab suspects that scientist accidentally threw the vial away in November.
…
Galveston biolab requires the most stringent safety measures because it studies biosafetly level BSL-4 materials, or dangerous infectious diseases that have no vaccines or cures. BSL-4 materials include Guanarito, Ebola and smallpox.

التاريخ يعرف تسريبات أخرى واسعة النطاق . على سبيل المثال ، "إحياء" فيروس إنفلونزا H1N1 في عام 1977 ، والذي كان يُعتقد سابقًا أنه اختفى. نعم ، هذا هو فيروس "المرأة الإسبانية" نفسها:

H1N1 1918 , ( 1947 ), 1957 «» H2N2, . H1N1, -, , 20 . 1969 H3N2 H2N2 .

1977 . H1N1 , 1978 . , 1977 . H1N1 - , , . , , , H1N1 1977 H1N1, 1949–1950 , , .
…
2009–2010 . , H1N1 1977 : « — A H1N1, 1977 ».
…
, 1977 . H1N1, , « » (Kung 1978). , , , 1970- ( ) . .

, , 1977–78 . - , , -, H1N1 1978 . H1N1, , . 1976–77 20 H1N1 1957, . 1977 , .
Human influenza H1N1 viruses appeared with the 1918 pandemic, and persisted, slowing accumulating small changes in its genome (with a major change in 1947), until the H2N2 “Asian” flu appeared in 1957, causing a worldwide pandemic. H1N1 influenza virus then apparently became extinct, and was not isolated for 20 years. In 1969 the “Hong Kong” H3N2 virus replaced the H2N2 virus, and is still circulating.
In September 1977 an H1N1 influenza virus was isolated from human infections in the Far East region of the Soviet Union, and in early 1978 the Chinese reported they had isolated H1N1 virus in May of 1977 in northeast China adjacent to the Soviet outbreak. Using the early genetic tools available at the time, the 1977 H1N1 virus was found to be closely related to H1N1 human influenza viruses circulating in 1949–1950, but not to those circulating earlier or later.
…
Only since 2009–2010 did major papers begin to state directly the 1977 emergence of H1N1 influenza was a laboratory related release: “The most famous case of a released laboratory strain is the re-emergent H1N1 influenza A virus which was first observed in China in May of 1977 and in Russia shortly thereafter.”
…
The speculation that the 1977 release may have been related to H1N1 vaccine research is supported by the observation that in the initial outbreaks in China, nine of the ten viral isolates expressed “temperature sensitivity” (Kung 1978). Temperature sensitivity normally an uncommon trait, but one that was in the 1970s (and still is) a fundamental trait for making live attenuated influenza vaccines. Temperature sensitivity generally occurs only after a series of substantial laboratory manipulations and selections.
Interestingly, further investigation indicated the circulating strains in 1977–78 were often comprised of mixed temperature-sensitive and normal components, and that temperature sensitivity apparently disappeared from the post-1978 H1N1 lineage rapidly. Escape of a mid-protocol population of H1N1 virus undergoing laboratory selection for temperature sensitive mutants would provide such a mixed population. In 1976–77 laboratory personnel in their late teens or early 20s would not have been exposed to pre-1957 H1N1 influenza viruses, and been susceptible to laboratory infections. The low severity of the 1977 pandemic might be in part due to the temperature sensitivity of the virus, a trait that limits virus replication in pulmonary tissues.

يبدو أن إنشاء طفرات فيروسية حساسة لدرجة الحرارة لتطوير لقاحات "مخففة" محتملة كانت منتشرة على نطاق واسع في نهاية القرن العشرين. إذا كنت تتذكر ، في عام 1990 ، جرب Barik أيضًا إنشاء سلالات حساسة للحرارة.

هل يمكن لشيء مثل هذا أن يسبب جائحة الفيروسات التاجية لعام 2019؟ لما لا؟ هنا العديد من الخيارات ممكنة - من تطوير لقاح محتمل إلى مجرد بحث عن إعادة التركيب المختبري لفيروسات الخفافيش والبنغولين. يمكن لبعض الباحثين الطموحين بشكل خاص أن يقرروا حتى المبادرة الشخصية للجمع بين "موضوعات الموضة" - إضافة موقع فيورين ونقل RBM من سلالة نوع واحد (بانجولين) إلى نوع آخر (الخفافيش) ، بحيث يؤكد لاحقًا زيادة الضراوة للتصميم الخيمري الجديد ، لنشر مقال آخر هائل حول الخطر الذي ينتظر البشرية في كهوف يونان أو في الأسواق الرطبة. وإذا كان من الممكن إنشاء لقاح ضد هذه السلالة الخطيرة بشكل وقائي ، فسيكون ذلك شرفًا واحترامًا لمثل هذا الباحث.

هل أؤكد أنه كان كذلك؟ بالطبع لا. لأنه اليوم لا يوجد دليل على مثل هذا السيناريو. لا يوجد سوى سلسلة من الصدفات الغريبة - على سبيل المثال ، أن تفشي فيروس يونان التاجي حدث على بعد آلاف الكيلومترات من يونان في السوق الأقرب لمعهد ووهان للفيروسات. أو ربما ليس في السوق ، بسبب أول 4 مرضى مرضى ، لم يكن ثلاثة في السوق . حسنًا ، المصادفة في السمات الهيكلية لجينوم الفيروس ، والتي تشبه تلك التلاعبات التي قام بها علماء الفيروسات مرارًا وتكرارًا مع مثل هذه الفيروسات في المختبر. لكن الصدف ليست دليلا.

علاوة على ذلك ، تحدث المصادفات ، وبالطبع ، يمكن أن تنشأ هذه السلالة أيضًا في الطبيعة. ليس من الواضح بعد كيف بالضبط - لهذا ، كانت سلالات الخفافيش والبنغولينيوم تلتقي في خلية واحدة (خلية جسم شخص ما ، وليس الخلية المعدنية) ، وفي ووهان ، منذ ظهور الفاشية هناك (وإلا كنا قد رأينا بؤرًا أخرى من Covid بواسطة مسار الماشية الأولى إلى ووهان). بالنظر إلى أن الخفافيش لم يتم بيعها في سوق ووهان ، وعمومًا في حالة السبات في هذا الوقت من العام ، فإن هذا الخيار لا يزال لغزًا لم يتم حله.

بالمناسبة ، كانت هناك أنباء مؤخرًا أنه في عام 2018 ، قام خبراء أمريكيون بتفتيش معهد ووهان من قبل علماء الفيروسات ، بل وتحدثوا مع شي زنغلي. كانت نتيجة "جولتهم" برقيتين دبلوماسيتين إلى واشنطن ، لاحظوا فيه عددًا من نقاط الضعف في ضمان سلامة المختبر:

وقالت مصادر متعلقة ببرنامج Telegram أنه كان ينبغي عليها أن تدق ناقوس الخطر بشأن المشكلات الأمنية الخطيرة في مختبر WIV ، خاصة فيما يتعلق بعملها مع فيروسات التاجية الخفاش. دعا مسؤولو السفارة الولايات المتحدة إلى إيلاء المزيد من الاهتمام لهذا المختبر وتقديم دعم إضافي.
...
« WIV , , », — 19 2018 , , , WIV. ( .)
تلقى الباحثون الصينيون في WIV المساعدة من مختبر جالفستون الوطني في القسم الطبي بجامعة تكساس ومنظمات أخرى في الولايات المتحدة ، لكن الصينيين طلبوا مساعدة إضافية. يقول Telegrams أنه يجب على الولايات المتحدة تقديم المزيد من الدعم لمختبر ووهان ، ويرجع ذلك أساسًا إلى أن دراستهم للفيروسات التاجية الخفاش كانت مهمة ، ولكنها خطيرة أيضًا.
النص المصدر
Sources familiar with the cables said they were meant to sound an alarm about the grave safety concerns at the WIV lab, especially regarding its work with bat coronaviruses. The embassy officials were calling for more U.S. attention to this lab and more support for it, to help it fix its problems.
…
“During interactions with scientists at the WIV laboratory, they noted the new lab has a serious shortage of appropriately trained technicians and investigators needed to safely operate this high-containment laboratory,” states the Jan. 19, 2018, cable, which was drafted by two officials from the embassy’s environment, science and health sections who met with the WIV scientists. (The State Department declined to comment on this and other details of the story.)
The Chinese researchers at WIV were receiving assistance from the Galveston National Laboratory at the University of Texas Medical Branch and other U.S. organizations, but the Chinese requested additional help. The cables argued that the United States should give the Wuhan lab further support, mainly because its research on bat coronaviruses was important but also dangerous.

ومن المضحك أن المختبر تكساس في جالفستون، والتي في وقت واحد نفسها قد فقدت أنبوب اختبار مع فيروس الفنزويلي ، ساعد الناس ووهان . علاوة على ذلك ، ساعدت ليس فقط في الكلمات ، فقد تلقى المتخصصون في ووهان تدريبًا هناك ، والذي كتبه حتى نشرة ووهان (على الرغم من أنه تم حذف المنشور الآن من الموقع ، ولكنه لا يزال متاحًا في أرشيف الويب ):

اللمسة الأخيرة للصورة العائلية للتسربات المخبرية: في نوفمبر 2019 ، حدث تفشي داء البروسيلات (عدوى بكتيرية) في مركزين بحثيين في لانتشو ، مما أثر على أكثر من 100 باحث يعملون هناك.

آثار محتملة من صنع الإنسان

ثم اترك علماء الفيروسات وحدهم وأدر أعيننا مرة أخرى إلى الفيروس نفسه. هل هناك أي علامات واضحة على جنون الإنسان؟ أولاً ، بضع كلمات حول معنى "صريح". من الواضح أنه في الطبيعة يمكن أن تحدث أي طفرات تمامًا عن طريق الصدفة. حتى لو كانت الروابط التي خلقت موقع الفوران في CoV2 لم تكن "PRRA" ، ولكن "MADEINWVHANPRRA" ، فستظل هناك فرصة غير محتملة لظهورها. لكن بالنسبة لنا ، وأي محكمة ، أعتقد أن هذا سيكون كافيا لإثبات أصل من صنع الإنسان بما لا يدع مجالا للشك المعقول .

المشكلة الرئيسية في مثل هذه الأدلة هي أنه حتى في الفيروسات التي من صنع الإنسان قد لا تكون موجودة ببساطة. على وجه التقريب ، يمكن للمهندس الوراثي الجيد إنشاء فيروس اصطناعي "مطابق للفيروس الطبيعي". علاوة على ذلك ، غالبًا ما يقوم الباحثون عن عمد بإدخال طفرات مترادفة في هياكلهم بحيث يمكن تمييز سلالتهم والطبيعة الطبيعية لاحقًا. ولكن إذا لم يكشف خالق الفيروس عن علامات الجنون البشري هذه ، فمن المستحيل تمييزها عن الطفرات الطبيعية.

لكن في بعض الأحيان يمكن أن تبقى الآثار ، خاصة إذا لم يحاول المبدعون إخفاء جنون الرجل في تصميمهم. بادئ ذي بدء ، نحن نتحدث عن أماكن قطع الحمض النووي (أذكر أن التلاعب بفيروسات الحمض النووي الريبي تتم بدقة في تراكيب الحمض النووي الخاصة بهم) ، وهو ضروري لمنشئي المحتوى لخياطة شرائح مختلفة من الجينوم أو قطع مواقع قديمة وإدراج مواقع جديدة. في الواقع ، لا يمكن قطع الحمض النووي في الأماكن التعسفية (Crisper لا يحسب) ، ولكن فقط حيث يتزامن تسلسل النيوكليوتيدات (عادة 4-6 "أحرف") مع التسلسل المعترف به من قبل إنزيم تقييد واحد أو آخر ، أي إنزيم يكسر سلاسل النيوكليوتيد . علاوة على ذلك ، يعقد هذا التحليل حقيقة أن هناك مئات الأنواع المختلفة من إنزيمات التقييد المستخدمة في الهندسة الوراثية. ولكن دعونا نحاول إجراء مثل هذا التحليل لـ CoV2.

بادئ ذي بدء - مثال على عمل مجموعة Barik من عام 2008 ، حيث أخذوا Bat-SCoV واستبدلوا RBD في بروتينه المرتفع بـ RBD من السارس البشري. إليك كيف يصفون خلق الوهم الخاص بهم:

SARS-CoV Bat-SCoV.
(A) SARS-CoV Bat-SCoV ( GenBank FJ211859) . () nsp ORF1ab ( , - ; , nsp5 [3C- ]). , , A F. , Bat-SCoV, SARS-CoV, , Bat-SCoV 2 , Bat-E1 Bat-E2, SARS-E.
Schematic representation of SARS-CoV and Bat-SCoV variants.
(A) Schematic representation of SARS-CoV and Bat-SCoV (GenBank accession no. FJ211859) genomes and reverse genetics system. (Top) Arrowheads indicate nsp processing sites within the ORF1ab polyprotein (open arrowheads, papain-like proteinase mediated; filled arrowheads, nsp5 [3C-like proteinase] mediated). Immediately below are the fragments used in the reverse genetics system, labeled A through F. The fragments synthesized to generate Bat-SCoV exactly recapitulate the fragment junctions of SARS-CoV with the exception that the Bat-SCoV has 2 fragments, Bat-E1 and Bat-E2, which correspond to the SARS-E fragment.

كما ترون ، أنشأت مجموعة Barik في البداية استنساخًا اصطناعيًا من الخفاش Bat-SCoV ، علاوة على ذلك ، باستخدام "أنماط" استنساخ SARS-CoV الاصطناعي الذي أنشأوه مسبقًا. أي ، بالنسبة إلى استنساخ الخفافيش ، فقد استخدموا نفس الأجزاء الستة مع نفس مواقع الإنزيمات المقيدة التي استخدموها سابقًا لـ SARS-CoV ، مما سمح لهم بتبديل مقاطع الفيروسات بين سلالات مختلفة مثل قطع Lego. فيما يلي وصف تفصيلي لإنشاء متحولة خيميرية:

, - , SARS-CoV (24, 33, 53) . , Bat-F A-E SARS-CoV F Bat-SCoV, Bgl-NotI. Bat-SCoV Bat-SRBD, Bat-SRBM Bat-Hinge , 7 Bat-SCoV, BglI Bat-A, Bat-B, Bat-C Bat -D, BglI AflII Bat-E1 Bat-E2 BglI NotI Bat-F. , . m7Message mMachine (Ambion), Vero (24, 53).
Viruses containing PCR-generated insertions within the viral coding sequence were produced by using the SARS-CoV assembly strategy (24, 33, 53) with the following modifications. Briefly, for Bat-F virus, full-length cDNA was constructed by ligating restriction products from SARS-CoV fragments A–E and Bat-SCoV fragment F, which required a BglI-NotI digestion. For Bat-SCoV and Bat-SRBD, Bat-SRBM, and Bat-Hinge, plasmids containing the 7 cDNA fragments of the Bat-SCoV genome were digested by using BglI for Bat-A, Bat-B, Bat-C, and Bat-D, BglI and AflII for Bat-E1 and Bat-E2, and BglI and NotI for Bat-F. Digested, gel-purified fragments were simultaneously ligated together. Transcription was driven by using a T7 mMessage mMachine kit (Ambion), and RNA was electroporated into Vero cells (24, 53).

كل هذه الاختصارات المكونة من ثلاثة أحرف (BglI ، AflII ، NotI ، إلخ) في الجملة الموضحة أعلاه هي أنواع مختلفة من إنزيمات التقييد. دعونا نرى ما إذا كانت هناك أي اختلافات في مواقع إنزيمات التقييد في الجينوم (بروتين سبايك) للخيمرا مقارنة بجينوم السارس - CoV الأصلي:

كما يتبين ، فإن مواقع الإنزيمات المقيدة للخيمرا مطابقة تقريبًا لتلك القطع من المتواليات الأصلية في Bat-SCoV أو SARS من حيث تم نقلها. الاختلافات الوحيدة مرئية في مواقع التشابك لقطعة السارس المدرجة. هنا ، على سبيل المثال ، الحافة اليسرى (5'-) للإدخال:

هنا اتضح أن Bat-SCoV و SARS لديهما منطقة نوكليوتيد متطابقة مشتركة (تقاطع المناطق الفيروزية والوردية) ، ولا توجد مواقع إنزيم تقييد جديدة في مكان التسلسل المتسلسل ، على العكس ، اختفى موقع SspI من سارز. وهنا الحافة اليمنى (3'-) للإدخال:

هنا ، على العكس من ذلك ، بقيت جميع مواقع إنزيمات التقييد القديمة في مكان الترابط ، وظهرت حتى مواقع جديدة ، على سبيل المثال ، EcoR II. إذا لم أكن أعلم أن الجينوم الكيمري ناتج عن تلاعب من صنع الإنسان ، فهل يمكنني فهم ذلك من خلال النظر إلى هذه التسلسلات الثلاثة؟ من غير المحتمل أنه حتى لو تسللت بعض الشكوك ، فمن المؤكد أنه لم يكن هناك شك معقول . ربما ، كان بإمكان المتخصصين في الهندسة الوراثية رؤية هذا لبعض العلامات الأخرى ، لا يمكنني الافتراض أن أقول - سأكون سعيدًا بأي برنامج تعليمي هنا.

ولكن على أي حال ، دعنا نقارن بروتين السنبلة في RaTG13 و CoV2 و pangolin-19. فجأة ، سيقفز شيء علينا وهو يقفز!

هذا ما يبدو عليه RBD (مظلل باللون الأخضر الفاتح) و RBM (أصفر) لجميع الثلاثة:

ما هو المثير للاهتمام؟ كان من المثير للاهتمام رؤية موقع EcoR I على حافة 5'من RBM لجميع الثلاثة (المفصل الأول بين المناطق الخضراء والصفراء) - مريح للغاية. أتساءل ما مدى شيوع هذه الميزة في سلالات أخرى؟ أظهر تحليل سريع أن ثالوثنا أبطال في عدد هذه المواقع في الجينوم ، في سلالات الخفافيش الأخرى هناك 5 فقط منها:

بالعودة إلى تحليل RBD ، من ميزات CoV2 ، يمكن ملاحظة مواقع إنزيمات التقييد الجديدة المظللة في المستطيلات الحمراء - وهي تتزامن مع طفرات فريدة في تسلسل الأحماض الأمينية (يتم تمييزها أيضًا بمستطيلات حمراء على تسلسلات الأحماض الأمينية في العمود الأيمن الأقصى). في هذه الحالة فقط ، سلطت الضوء على العديد من المواقع الجديدة: مستطيلات زرقاء ومستطيل أخضر ، يقع في منطقة الحمض الأميني الوحيد الذي يختلف بين RBM CoV2 و pangolin-19.

دعونا نقارن في جميع السلالات الثلاثة مكان إدخال PRRA ، الذي أنشأ موقع الفوران في CoV2:

هنا أيضًا ، ظهرت عدة مواقع جديدة (مظللة باللون الأزرق) على جانبي الإدخال الجديد. هل يمكن استخدامها لإنشاء موقع Furin؟ من الناحية النظرية ، نعم. ولكن يمكن إجراء الإدراج باستخدام المواقع الحالية ، أو حتى إنشاء شرائح بمواقع جديدة ، والتي يتم دمجها بعد ذلك بسلاسة ، أي بدون إنشاء مواقع جديدة عند التقاطع. إذا كنت تتذكر ، قام Barik مرة أخرى في عام 2002 بتطبيق هذه التقنية لإنشاء استنساخ اصطناعي من فيروس كورونا الفأري:

تتم إزالة مواقع الوصلات لمواقع التقييد الموجودة في نهايات كل cDNA بشكل منهجي أثناء تجميع منتج cDNA كامل الحجم بالكامل ، مما يسمح بإعادة التجميع دون تعديل النوكليوتيدات.
النص المصدر
The interconnecting restriction site junctions that are located at the ends of each cDNA are systematically removed during the assembly of the complete full-length cDNA product, allowing reassembly without the introduction of nucleotide changes.

وفي عام 2003 كرر على استنساخ السارس الاصطناعية الاصطناعية:

لتجميع استنساخ الإجماع بسرعة ، استخدمنا نوكليازات تقييد فئة IIS ، والتي يتم قطعها في مناطق غير متماثلة وترك نهايات غير متماثلة. تولد هذه الإنزيمات تراكمًا فريدًا محددًا يوفر ربطًا سلسًا لاثنين من cDNA مع فقدان لاحق لموقع التقييد .
النص المصدر
To rapidly assemble consensus clones, we used class IIS restriction endonucleases that cut at asymmetric sites and leave asymmetric ends. These enzymes generate strand-specific unique overhangs that allow the seamless ligation of two cDNAs with the concomitant loss of the restriction site.

اليوم ، أصبحت تقنية الشعوذة بتسلسل الجينات مؤتمتة للغاية بالفعل وتم بثها في مقال صيني في أكتوبر 2019 حول إدراج موقع فرين جديد في فيروس التاجي بالدجاج ، لا يوجد سوى اقتراحان لوصفه:

2.2. تكوين
فيروس مؤتلف تم الحصول على الفيروس المؤتلف rYN-S2 / RRKR ، الذي يحتوي على بروتين سبايك مع موقع Furin S2 '، عن طريق إعادة التلقيح ، كما هو موضح سابقًا [20 ، 28]. لفترة وجيزة ، تم إنشاء بلازميد S-furin في الموقع باستخدام مجموعة التجميع السلس (Invitrogen ، Carlsbad ، CA ، USA) وتم نقله إلى خلايا CV-1 المصابة بفيروس لقاح يحتوي على الجين YN- S-GPT. تم إدخال موقع Furin-S2 في YN cDNA عن طريق إعادة التركيب المتماثل باستخدام نظام اختيار مهيمن مؤقت [25].
النص المصدر
2.2. Generation of Recombinant Virus
Recombinant rYN-S2/RRKR virus containing an S protein with the furin-S2? site was generated by vaccinia recombination, as described previously [20,28]. Briefly, plasmid with the furin-S2? site was generated using the Seamless Assembly kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) and transfected into CV-1 cells infected by vaccinia virus containing the genome of YN-?S-GPT. Furin-S2’ site was introduced into the YN cDNA by homologous recombination using the transient dominant selection system [25].

من المستحيل عدم الإعجاب بالتقدم المحرز! فيما يلي وصف لمجموعة التجميع السلس أعلاه :

GeneArt 1 4 , , 30- . E.coli .
• — 4 ( 13 ); ,
• — , , , 90% .
• —
• — - -,
• — , , .
The GeneArt Seamless Cloning and Assembly Kit enables the simultaneous and directional cloning of 1 to 4 PCR fragments, consisting of any sequence, into any linearized vector, in a single 30-minute room temperature reaction. The kit contains everything required for the assembly of DNA fragments, and their transformation into E. coli for selection and growth of recombinant vectors.
• Speed and Ease?—?Clone up to 4 DNA fragments, with sequence of your choice, simultaneously in a single vector (up to 13 Kb); no restriction digestion, ligation or recombination sites required
• Precision and Efficiency — Designed to let you clone what you want, where you want, in the orientation you want, and achieve up to 90% correct clones with no extra sequences left behind
• Vector Flexibility — Use our linear vector or a vector of your choice
• Free Tools — Design DNA oligos and more with our free web-based interface that walks you step-by-step through your project
• Diverse Applications — Streamline many synthetic biology and molecular biology techniques through the rapid combination, addition, deletion, or exchange of DNA segments

يمكن لصق ما يصل إلى 4 أجزاء من الحمض النووي في التسلسل المطلوب في نصف ساعة فقط ، دون صداع مع إنزيمات تقييد أو ربط. وتحميل إبداعك إلى E. coli لنشر التصميم الناتج.

تلخيص تحليل مواقع انزيم التقييد ، يجب الاعتراف بأنه لا يمكن استخلاص نتائج محددة من نتائجها. ما لم يكن مرة أخرى كان من الممكن التأكد من أن CoV2 ليس فريدًا فحسب ، ولكن RaTG13 نفسه صديق غير معتاد للغاية ، وأنه يستحق مواصلة دراسة سيرته الذاتية.

تفضيلات Codon

لهذه الأغراض ، قررت أيضًا إلقاء نظرة على تحيز استخدام الكودون للنظر في سلالات الفيروسات الأخرى التي تبدو مثل CoV2 و RaTG13. ليس سراً أن الفيروسات تميل إلى التكيف في توقيع الكودون مع تفضيلات مضيفيها ، لذلك توقعت أن أرى نمطًا مشابهًا مع فيروسات الكبد الأخرى في RaTG13 ، وآمل أيضًا أن أرى اختلافًا عن سلالات بانجولين.

هنا SARS-CoV ، على سبيل المثال ، يشبه إلى حد كبير Rs3367 و RsSCH014 ، كما قد تتوقع:

فيما بينهم ، بالمناسبة ، يختلف السارس و MERS و CoV2:

RaTG13 يشبه CoV2 ، والذي من المتوقع أيضًا:

لكن RaTG13 لا يشبه في الواقع سلالات بانجولين ، وسلالات البانجولين ليست متطابقة تمامًا مع بعضها البعض:

على ZXC21 و ZC45 ليست متشابهة جدًا:

من سلالات يونان ، RaTG13 من Rs3367 و RsSCH014 بعيد جدًا ، وأقرب إلى LYRa11 ، ولكن أيضًا مع اختلافات ملحوظة:

بشكل عام ، كما هو الحال دائمًا ، يتم فصل RaTG13 و CoV2 بطريقة أو بأخرى. لقد كنت مفتونًا أيضًا برمز AAA - فهم يستخدمونه في كثير من الأحيان أكثر من زملائهم القبائل:

ربما تكون هذه مجرد مصادفة أخرى ، ولكن لوحظت نسبة مماثلة بين AAA و AAG في E. coli . هل يمكن أن يتغير توقيع [كدنا] من كدنا لأنه يزرع لفترة طويلة في ثقافة الخلية؟ من الناحية النظرية ، نعم ، لكني لم أحفر هذا الموضوع بعمق حتى الآن.

حسنًا ، لم يكشف تحليل الكودون عن أي علامات واضحة للإبداع ، ولكنه أكد مرة أخرى تفرد CoV2 و RaTG13. ماذا لدينا في حالة جافة؟ حتى الآن ، هناك مجموعة معينة فقط من الصدفات الغريبة ، والتي ، كما يحب العلماء القول ، مجتمعة ، أي في المجموع ، تجعلك تفكر بجد. وبالتأكيد لا يسمح برفض الفرضية حول طبيعة CoV2 من صنع الإنسان.

ولكن ماذا عن تفنيد جنون الإنسان في الطبيعة؟

كيف لا تسمح؟ ولماذا يسمح كاتب هذا المقال في Nature؟ في الواقع ، لا يوجد دحض لجنون الإنسان في تلك المقالة. لا يوجد سوى عبارة "لا نعتقد ذلك" بصوت عالٍ ، بناءً على أساس غير مستقر للغاية. احكم بنفسك - هذه هي النقاط الرئيسية للمؤلفين لدعم المعجزة:

, SARS-CoV-2 ACE2 , , , RBD SARS-CoV [ SARS — ..] . , SARS-CoV-2 ACE2, , ACE2, . , SARS-CoV-2 .
While the analyses above suggest that SARS-CoV-2 may bind human ACE2 with high affinity, computational analyses predict that the interaction is not ideal and that the RBD sequence is different from those shown in SARS-CoV to be optimal for receptor binding. Thus, the high-affinity binding of the SARS-CoV-2 spike protein to human ACE2 is most likely the result of natural selection on a human or human-like ACE2 that permits another optimal binding solution to arise. This is strong evidence that SARS-CoV-2 is not the product of purposeful manipulation.

يظهر هذا الاقتباس في المقالة أسفل الرسم التخطيطي الذي يوضح RBMs المتطابق لـ CoV2 و pangolin-19. انتظر ، إذن ما علاقة "محاكاة الكمبيوتر" بها؟ السيناريو الأكثر احتمالا من صنع الإنسان هو نقل RBM من سلالة حيوان إلى سلالة حيوان آخر - وهو ما فعله علماء الفيروسات مرارا وتكرارا. لذلك ، لا تتصدى السلسلة المنطقية للمؤلفين للنقد: "على الكمبيوتر ، كان من الممكن تصميم فيروس أكثر حدة ، لذا فإن CoV2 هو نتيجة الانتقاء الطبيعي. أوه ، هذا دليل قوي على أن CoV2 لا يصنع باليد! " يبدو أن المؤلفين لديهم منطق سيء. تؤكد أطروحاتهم الإضافية هذا:

, , , , -. , , SARS-CoV-2 - .
Furthermore, if genetic manipulation had been performed, one of the several reverse-genetic systems available for betacoronaviruses would probably have been used. However, the genetic data irrefutably show that SARS-CoV-2 is not derived from any previously used virus backbone.

مرة أخرى ، نفس الخطأ المنطقي ، المحجوب بمنعطفات صاخبة: "يثبت التحليل الجيني بشكل لا يمكن دحضه أن CoV2 لم يتم إنشاؤه بالتأكيد على أساس الفيروسات المعروفة سابقًا!" حسنا شكرا الكابتن الدليل. وماذا ، في الواقع ، لم يتمكن مبدعو الفيروس من صنع مادة cDNA الأساسية من سلالة غير منشورة سابقًا من الفيروس - على سبيل المثال ، من نفس RaTG13؟ نعم سهل. أيضا ، لن يكون من الصعب عليهم بعد ذلك إدخال RBM pangolinium وموقع الفوران هناك. يقوم علماء الفيروسات بذلك منذ 20 عامًا ، وأدوات الهندسة الوراثية الحديثة تجعل مثل هذه التلاعبات متاحة حتى للطلاب.

أما فيما يتعلق بأصل موقع الفوران في زراعة الخلايا ، فإن المؤلفين يعبرون أيضًا عن أطروحات غريبة:

, O- . in vitro in vivo. , SARS-CoV-2 - , . ACE2, , .
The acquisition of both the polybasic cleavage site and predicted O-linked glycans also argues against culture-based scenarios. New polybasic cleavage sites have been observed only after prolonged passage of low-pathogenicity avian influenza virus in vitro or in vivo. Furthermore, a hypothetical generation of SARS-CoV-2 by cell culture or animal passage would have required prior isolation of a progenitor virus with very high genetic similarity, which has not been described. Subsequent generation of a polybasic cleavage site would have then required repeated passage in cell culture or animals with ACE2 receptors similar to those of humans, but such work has also not previously been described.

أولاً ، قدم المؤلفون أنفسهم سابقًا روابط لأعمال حيث نشأ موقع فيرين حيث تم زراعة الفيروسات في الخلايا. وثانيًا ، ماذا يعني أنه لم يتم وصف سلالة مماثلة من الفيروس - ولكن ماذا عن RaTG13؟ إذا تم استبدال RBM صناعيًا بالبنغولينيوم فيه ، ثم تم استزراع سلالة خيمرية في ثقافة الخلية ، يمكن أن يظهر موقع الفوران بهذه الطريقة بالإضافة إلى ذلك ، بنفس الطريقة ، يمكن للسلالة الجديدة أن تكتسب طفرات أخرى تميز CoV2 عن RaTG13 و pangolin-19 .

ولكن من حيث الشكل البديل بالضبط من صنع الإنسان لظهور موقع الفرو ، فمن المرجح أن أرى الخيار مع إدراج مستهدف - كما هو الحال في عمل صيني آخر من أكتوبر 2019 مع فيروس كورونا. وبعد ذلك يمكن أن تكتسب السلالة التي تم إنشاؤها طفرات جديدة لأنها تزرع في المختبرأو في الجسم الحي على أنه سلالة الفئران من MA15 في عام 2007، على سبيل المثال.

شي Zhengli 2020

بينما كنت أكتب هذا المقال ، ظهر عمل فريق كبير من علماء الفيروسات الصينيين ، بما في ذلك شي زنغلي ، حيث اختبروا في فبراير ضد CoV2 سنواتهم الطويلة من التطور من العديد من أنواع الفيروسات التاجية - الببتيد الذي تم تصميمه لمنع اندماج بروتين شبيه بالارتفاع مع غشاء الخلية. يذكر المؤلفون ، بالطبع ، موقع Furin الجديد لـ CoV2 ، ويقترحون أنه يمكن أن يلعب دورًا مهمًا في الاختراق الأكثر كفاءة لـ CoV2 في الخلية:

, SARS-CoV-2 , SARS-CoV, , SARS-CoV-2 .
…
, β- S1/S2, . , SARS-CoV , L . S1/S2 SARS-CoV .
In this study, we have shown that SARS-CoV-2 exhibits much higher capacity of membrane fusion than SARS-CoV, suggesting that the fusion machinery of SARS-CoV-2 is an important target for development of coronavirus fusion inhibitors.
…
Generally, β-B coronaviruses lack the S1/S2 furin-recognition site, and their S proteins are uncleaved in the native state. For example, SARS-CoV enters into the cell mainly via the endosomal membrane fusion pathway where its S protein is cleaved by endosomal cathepsin L and activated. Inducing the S1/S2 furin-recognition site could significantly increase the capacity of SARS-CoV S protein to mediate cellular membrane surface infection.

في هذا السياق ، يصبح الأمر مثيرًا للاهتمام ، ولكن هل أجرى المؤلفون سابقًا بعض التجارب حول كيفية تأثير إضافة مواقع الفوران الجديدة على الفيروسات التاجية المختلفة على فعالية الببتيد؟ لكننا لن نبني تخمينات غير ضرورية ، ودع الوقت يضع كل شيء في مكانه.

بالمناسبة ، قرر باريك ، على ما يبدو ، مواكبة شي Zhengli ، وانضم أيضًا إلى السباق للعثور على أموال من CoV2. كما أفهمها، أخذ هو والمشاركين فيها البيانات التي لديها بالفعل على فعالية التناظرية على نيكليوزيد (β-D-N4-hydroxycytidine، NHC) ضد السارس COV وMERS وأضاف في المختبر البيانات على CoV2، وإرساله للطباعة. نظائرها Nucleoside (مثل remdesivir الشهير) هو نهج مختلف جوهريًا عن نهج شي زنغلي والمؤلفين المشاركين: هنا يحاول المؤلفون منع الفيروس من التكاثر عن طريق انزلاق الحروف "المعيبة" من الأبجدية الجينية ، ويحاول شي زينغلي والمؤلفون المشاركون منع الفيروس من دخول الخلية. من الناحية النظرية ، يمكن الجمع بين هذه النهج.

هذه هي النهاية يا صديقي الجميل

أوه ، آمل حتى هذه اللحظة على الأقل يقرأ شخص ما. آسف إذا ولدت لك. نفسه في حالة صدمة: تبين أن حفرة الأرنب هي مملكة كاملة تحت الأرض. آمل أيضًا أنه كان من المثير للاهتمام بالنسبة لك أن تغوص في عالم علم الفيروسات وأن تفكر بعقلانية في فرضية الطبيعة الاصطناعية من CoV2. في رأيي ، فإن مجموعة البيانات التي ذكرتها ، بشكل إجمالي ، لا تسمح برفض هذه الفرضية.

في هذه الحالة فقط ، سأشرح: هذا لا يعني أن CoV2 تم تصنيعه بدقة في المختبر. نعم ، من الناحية التقنية البحتة ، لن يكون من الصعب على عالم الفيروسات الحديث أن يخلق مثل هذه السلالة. ولكن لا يوجد دليل مباشر على أن أي شخص فعل ذلك. والصدف الغريب لا يمكن أن يخدم حتى الآن كدليل غير مباشر.

لكن الفرضية العكسية حول الطبيعة الطبيعية الخالصة للفيروس ليست مدعومة أيضًا بأدلة قوية. حتى الآن ، لم يتم العثور على أسلاف وسيطة بين RaTG13 و pangolin-19 و CoV2 ، حيث سيكون من الممكن تتبع إعادة التركيب الانتقائي الذي نلاحظه في CoV2 ، لا تزال مسألة أصله مفتوحة. ربما لا يتحدث أحد أفضل من رالف باريك نفسه :

ما هي الحيوانات التي تنتقل من الحيوانات إلى سارس - CoV-2؟
لم يتم العثور على مثل هذه الحيوانات حتى الآن. هناك دليل على أن البنجولين يمكن أن يكون مضيفًا وسيطًا ، ولكن فيروسات البنغولين لا تتطابق إلا مع 88-98 ٪ فقط من فيروس السارس - CoV-2. للمقارنة ، كانت سلالات فيروسات الزباد والراكون من السارس الأول مطابقة بنسبة 99.8٪ لسلالات 2003 من سارس - CoV. وبعبارة أخرى ، نحن نتحدث عن عدة طفرات بين سلالات الزباد والراكون والبشر في عام 2003. تحتوي سلالات بانجولين [سلالات CoV2] على أكثر من 3000 تغير في النوكليوتيدات ، لذا لا يمكن أن تكون أنواع البانجولين بأي حال من الأحوال نوعًا من الخزانات. لا توجد فرصة على الإطلاق.
النص المصدر
What is the reservoir species of SARS-CoV-2?
They have not identified the actual reservoir species. Reports show that pangolins are potentially the intermediate host, but pangolin viruses are 88–98% identical to SARS-CoV-2. In comparison, civet and racoon dog strains of SARS coronaviruses were 99.8% identical to SARS-CoV from 2003. In other words, we are talking about a handful of mutations between civet strains, racoon dog strains and human strains in 2003. Pangolin [strains of CoV2] have over 3000 nucleotide changes, no way they are the reservoir species. Absolutely no chance.

هكذا يذهب.

******************************************************* ***************************

UPD: حوالي 4٪ من الفرق بين جينومات RaTG13 و Cov2

جادل بعض منتقدي الفرضية المختبرية بأن الاختلاف الجيني الملاحظ ~ 4٪ بين RaTG13 و CoV2 أكبر من أن يحدث هذا في المختبر إذا تم استخدام RaTG13 نفسه كأساس. تتباين معدلات الطفرة الملحوظة لفيروسات RNA بشكل كبير - من 10 ^-6 إلى 10 ^-4 نيوكليوتيدات لكل تكاثر في المختبر ، وفي البشر ، يبدو أن CoV2 يتحور بمعدل 25 طفرة في السنة. وبالتالي ، وفقًا لمنطق النقاد ، سيستغرق الأمر سنوات ، إن لم يكن عقودًا ، لكي تتباعد هاتان السلالتان بنسبة 4٪. على الرغم من حقيقة أن هذا اعتراض معقول ، إلا أنني أرى عدة مشاكل معه.

أولا ، معدلات الطفرة في المختبر أعلى بكثير منفي الجسم الحي ، حيث يمكنك مرور الخلايا في كثير من الأحيان أكثر من إصابة الحيوانات الجديدة. كما يتضح من التجارب مع السارس و MERS في المختبر ، يمكن ملاحظة طفرات كبيرة بعد عدة ممرات. على سبيل المثال ، أفيد في مقال عام 2004 أنه بعد 600 مقطع ، لوحظ بالفعل اختلافات بنسبة 2.1 ٪ في التسلسل الجينومي للبروتينات الشبيهة بالطفرة بين السلالة الأصلية ونسلها:

علاوة على ذلك ، في وجود بعض الأدوية المضادة للفيروسات ، على سبيل المثال ، نفس نظائر النيوكليوسيد (الريبافيرين أو الريميسيفيدير) ) ، يمكن أن يزيد تكرار الطفرات في فيروسات RNA بثلاثة أضعاف:

. 10-4 , -. , 6 . in vitro , , , .
We obtained an estimate of the spontaneous mutation rate of ca. 10^-4 substitutions per site or lower, a value within the typically accepted range for RNA viruses. A roughly threefold increase in mutation rate and a significant shift in mutation spectrum were observed in samples from patients undergoing 6 months of interferon plus ribavirin treatment. This result is consistent with the known in vitro mutagenic effect of ribavirin and suggests that the antiviral effect of ribavirin plus interferon treatment is at least partly exerted through lethal mutagenesis.

وبالتالي ، إذا تم اختبار سلف المختبر لـ CoV2 لتقييم كيف يمكن لطفراته أن تغير فعالية اللقاحات المحتملة أو الأدوية المضادة للفيروسات ضدها ، فقد تتراكم بسرعة كبيرة اختلافات كبيرة.

ولكن ربما تكون المشكلة الأكبر في حجة فرق 4 ٪ هي أنها تستند إلى حقيقة أن سلالة RaTG13 هي بالضبط ما أعلنته WIV ، وأنه لا توجد سلالات أخرى أقرب في مجموعتها. إذا أردنا أن نأخذ في الاعتبار علانية فرضية تسرب المختبر ، يجب أن نعترف بأنه لا يمكننا الوثوق بشكل كامل بالبيانات من نفس المختبر المشتبه في حدوث تسرب. إذا حدث التسرب ، كما تشير الفرضية ، فإن WIV تحاول بالفعل إخفاءه ، وقد تتبع البيانات التي تقدمها نفس الهدف.

, 100%- , . , , , , , , , . — — CoV2 , , , , , . , , , . , , , , .

بالمناسبة ، هناك شيء يمكن أن يساعد في تصديق ادعاءات WIV حول طبيعة RaTG13 - إذا وافقوا على نقل عينات يونان الخاصة بهم من عام 2013 ، والتي استخرج منها شي Zhengli RaTG13 ، إلى مختبرات مستقلة. لا يزال عليهم الحصول عليها إذا قاموا بتسلسل جينوم RaTG13 الكامل منهم مرة أخرى في عام 2020.

******************************************************* ***************************

UPD2: RaTG13 - نفس سلالة RaBtCoV / 4991؟

بعد أن نشرت هذا المنشور ، تمت الإشارة إلى مرحلة ما قبل الطباعة تشير إلى أن RaTG13 قد يكون في الواقع سلالة من RaBtCoV / 4991 ( KP876546 ) ، والتي أفاد شي Zhengli لاكتشافها في عام 2013 في منجم يونان مهجور في عام 2016 . هناك عدة أسباب للاعتقاد بذلك. بادئ ذي بدء ، فإن التسلسل الوحيد المنشور من RaBtCoV / 4991 مطابق تمامًا لتسلسل مستوى النوكليوتيدات RaTG13 ، على الرغم من أن هذا هو 370 نيوكليوتيدات فقط من جين RdRp:

ثانيًا ، البيانات الخاصة بتجميع المواد التي تم عزل هذه السلالات منها متطابقة تقريبًا: تم جمع كليهما في يوليو 2013 من مسحة الخفافيش من R. affinis :

تم جمع عينة من RaBtCoV / 4991 في منجم يقع في مقاطعة Mujiang ، والتي تقع تحت ولاية Puer:

منطقة Mujiang ذاتية الحكم هي منطقة حكم ذاتي تحت ولاية مدينة Puer ، في جنوب يونان ، الصين. ويكيبيديا

يشار إلى مدينة بوير كمكان تجمع RaTG13 في قاعدة بيانات GISAID ، والتي قد تكون مؤشراً تقريبيًا لموقع المنجم في Mujiang.

ومن الغريب أن في كتابه 2020 المادة على RaTG13، شي Zhengli لا يذكر RaBtCoV / 4991 ولا أذكر له 2016 المادة على اكتشافه، الذي يشار إليه باسم "تطوير وتنسيق الدراسة". في الوقت نفسه ، من غير المحتمل أن يتم نسيان RaBtCoV / 4991 تمامًا ، نظرًا لأنه مذكور في مقالة لمجموعة Shi Zhengli من عام 2019 ، حيث يتم تضمينه في شجرة التطور الوراثي للفيروسات التاجية الأخرى:

أشك في أن مكان RaBtCoV / 4991 في هذه الشجرة تم تحديده فقط على أساس جزء من 370 نيوكليوتيدات ، لذلك أعتقد أنه بحلول بداية عام 2019 ، كانت مجموعة Shi Zhengli قد قامت بالفعل بتسلسل جينومها.

بالمناسبة ، من المثير للاهتمام أن جينومات pangolin-2017 و pangolin-2019 قريبة جدًا أيضًا من RaTG13 و CoV2 في هذه المنطقة من جين RdRp ، و CoV2 و pangolin-2019 لديهم العديد من الطفرات الشائعة التي لم تتم ملاحظتها في RaTG13:

قررت أيضًا مقارنة ملف تعريف الكودون بين RaTG13 وسلالات أخرى من R. affinis تعيش في نفس المنجم المهجور. لسوء الحظ ، تم نشر مقاطع 816-nucleotide فقط من جين RdRp ( RaBtCoV / 3750 و RaBtCoV / 4307–2 ) لسلالات Ra الأخرى ؛ لذلك ، لمقارنة تفضيلات الكودون ، قمت باستخراج مقطع 816-nucleotide المقابل من RaTG13. ونتيجة لذلك ، تختلف RaTG13 بشكل ملحوظ مرة أخرى ، في حين أن السلالتين الأخريين قريبتان جدًا:

سارس معجزة؟ علم الأنساب من ووهان Coronavirus

دقيقة العناية UFO

نحثك على انتقاد أي معلومات منشورة.