Get best of the week

"انظروا ، هذا شيء": التكاثر الذاتي للحمض النووي الاصطناعي



واحدة من السمات المميزة الرئيسية لأي كائن حي هي القدرة على حفظ وإعادة إنتاج المعلومات الضرورية لخلق نوع خاص بهم. يتجلى هذا في المقام الأول في تضاعف الحمض النووي ، عندما يظهر زوج من الابنة من نفس الحمض النووي الأم ، والتي هي نسخة طبق الأصل من سلفهم. في الطبيعة ، تتم ملاحظة هذه العملية في كل مكان ، ولكن من الصعب للغاية إعادة إنشائها في ظروف مخبرية من الصفر ، ومع ذلك ، فهي واقعية تمامًا.

علماء من معهد الكيمياء الحيوية. نجح ماكس بلانك (ألمانيا) في إنشاء نظام بيولوجي لديه القدرة على تكرار الحمض النووي الخاص به. ما التقنيات التي تم استخدامها لإنشاء الحمض النووي المتماثل الاصطناعية ، وما مدى فعالية النظام الناتج ، وماذا يعني هذا الاكتشاف للبيولوجيا الاصطناعية الحديثة؟ سنجد إجابات لهذه الأسئلة في تقرير العلماء. اذهب.

أساس الدراسة


في مجال إنشاء أنظمة بيولوجية اصطناعية ، تعد القدرة على التكرار جانبًا رئيسيًا من فائدة النظام الذي تم إنشاؤه. وفقا للعلماء ، يمكن تحقيق ذلك من خلال تنفيذ المكونات الأساسية: النسخ * ، النسخ * ، ترجمة الحمض النووي * .
* — .
* — , .. .
* — , .
وبعبارة أخرى ، من أجل خلق حياة اصطناعية كاملة ، من الضروري تنفيذ التكاثر المشفر ذاتيًا ، أي النسخ الذاتي. هذه عملية معقدة ومربكة للغاية.

لاحظ مؤلفو الدراسة أنه في الأنظمة القائمة على الكيمياء الحيوية الموجودة ، على سبيل المثال ، MPC ( الحد الأدنى من الخلايا القائمة على البروتين) ، يتطلب النسخ الذاتي إعادة التفكير الكامل في البيولوجيا الجزيئية ، بما في ذلك النسخ والنسخ وترجمة الحمض النووي ، مع مراعاة بيئة خالية تمامًا من الخلايا.

يمكن تحقيق تخليق البروتين من الحمض النووي في بعض الأنظمة المؤتلفة التي تعتمد على بلمرة Phage * RNA polymerases - الأجزاء الرئيسية من آلية ترجمة Escherichia coli ونظام الحد الأدنى من تجديد الطاقة ، أي. نقي - تخليق البروتين باستخدام العناصر المؤتلفة (تخليق البروتين باستخدام العناصر المؤتلف).
البكتيريا أو العاثيات * هي فيروسات تصيب بشكل انتقائي الخلايا البكتيرية والخلية. في علم الأحياء ، يتم استخدامه كمتجه (DNA لنقل المواد الوراثية إلى الخلية).
وفي الوقت نفسه ، يظل من الصعب للغاية إعادة إنشاء عملية نسخ الحمض النووي للجينوم استنادًا إلى النسخ والترجمة (TTcDR - النسخ - النسخ المتماثل للحمض النووي المرتبط بالترجمة ) ، الذي يشفر جميع المكونات الجزيئية الكبيرة لنظام PURE باستخدام نسخة مشفرة ذاتيًا * .
Replisoma * هو مركب متعدد البروتينات ينسخ الحمض النووي البكتيري.
يمكن أن يساعد تكرار الحمض النووي القائم على بوليميرا DNA (DNAP) من العاثيات (على سبيل المثال ، Phi29) في تنفيذ تقنية TTcDR.

ومع ذلك ، في طريقة TTcDR ، لا يمكن تحقيق جينوم Phi29 كامل الحجم إلا عن طريق حجب بعض عوامل التكرار.

جميع الأساليب المذكورة أعلاه لها مزاياها النظرية ، ولكن في الممارسة لم تعط نتيجة كاملة. في العمل الذي نفكر فيه اليوم ، يصف العلماء نظام ترجمة يوفر نسخًا مشفرًا ذاتيًا والتعبير عن جينومات DNA كبيرة في ظل ظروف محددة وخالية من الخلايا. على وجه الخصوص ، تم تحقيق التكاثر الذاتي للجينوم أكثر من 116 كيلو بايت. (ألف زوج من النيوكليوتيدات) ، تغطي مجموعة كاملة من عوامل الترجمة الإشريكية القولونية(Escherichia coli) ، جميع الرناوات الريبوزومية الثلاثة ، ونظام تجديد الطاقة ، بالإضافة إلى الحمض النووي الريبي والبوليميرازات * .
بوليميراز * هو إنزيم يقوم بتوليف بوليمرات الأحماض النووية. يعمل DNA polymerase على تكوين DNA ، ويقوم RNA polymerase بتكوين RNA. تستمر هذه العملية من خلال النسخ التكميلية للحمض الأبوي أو الحمض النووي الريبي.
بالإضافة إلى ذلك ، أظهر النظام الذي تم إنشاؤه القدرة على تجميع أكثر من 30 عامل ترجمة ، نصفها يعبر عنه بكميات تساوي أو أكبر من العوامل التمهيدية.

نتائج البحث


في المرحلة الأولى ، اختبر العلماء TTcDR المعتمد على Phi29-DNAP باستخدام البروتوكول القياسي لنظام PURExpress .

تم استنساخ منطقة الترميز Phi29-DNAP التي يحيط بها المروج * T7 لأول مرة في ناقلات pCR-Blunt TOPO (pREP، 1a ).
المروج * هو تسلسل نوكليوتيد الدنا الذي يستخدمه بوليميراز RNA كمنطقة لبدء النسخ.


الصورة رقم 1 من

الناحية النظرية ، يجب أن توفر هذه العمارة نسخ RNA عفويًا كحلقة دوارة * باستخدام DNAP المشفر ذاتيًا بدون بروتينات نسخ إضافية أو بادئات DNA المقدمة خارجيًا.
عملية النسخ المتكرر لنوع الحلقة المتدحرجة * هي عملية نسخ الأحماض النووية أحادية الاتجاه يحدث خلالها تخليق سريع لنسخ متعددة من جزيئات DNA أو RNA الحلقية.
ومع ذلك ، باستخدام تفاعل PURExpress القياسي مع dNTP (نيوكليوتيد يحتوي على C 5 H 10 O 4 deoxyribose ) و 4 nM pREP (متوسط ​​LB مكمل بالزيوسين C 55 H 86 N 20 O 21 S 2 ) ، لم يتم الكشف عن تخليق DNA باستخدام الاغاروز الكهربائي للهلام * ، ولا بواسطة تفاعل سلسلة البلمرة في الوقت الحقيقي * ( 1 ب و 1 ج ).
* — , .
* — .
لتحسين تكرار الحمض النووي دون مشاركة أنظمة PURE المتخصصة ، تقرر تحسين بروتوكول تفاعل PURExpress القياسي. لهذا ، تم زيادة العدد النسبي لعوامل الترجمة ، الريبوسومات ، وعامل الاختزال مع خفض مستويات الحمض الريبي النووي النقال (النقل RNA) و rNTP (ريبونوكليوسيد ثلاثي الفوسفات) ( 1 د ).

باستخدام هذا التكوين بيور الأمثل (PURErep)، كان من الممكن لتحقيق تكرار ~5-12 أضعاف وحدات مركب بسيط الإعدادية في ردود الفعل TTcDR ( 1B و 1E ). تم تأكيد توليف pREP بالحجم الكامل عن طريق هضم MluI * لمنتج النسخ المتماثل ( 1c ).
MluI * هو نوكلياز مقيد متوفر تجاريًا ، أي إنزيم يحفز التحلل المائي للأحماض النووية.
تم استخدام تعبير بروتين فلوري الأخضر (sfGFP) كعامل تقييم لنشاط الترجمة. وجد أن التغيير في تركيبة PURE أدى إلى انخفاض تخليق البروتين بنسبة 20-40٪ مقارنة مع PURE بدون TTcDR. ومع ذلك ، يظل هذا الانخفاض في تعبير البروتين مقبولًا نظرًا للتوافق المحسن لنظام PURErep مع نسخ الحمض النووي.

كشف تحليل تضاعف الحمض النووي على أساس qPCR عن وقت مضاعف ثابت (1-2 ساعة) لتركيزات المصفوفة الأولية المختلفة ، بينما استمر تكرار الحمض النووي حتى بعد 24 ساعة عند 30 درجة مئوية ( 1e ).

كانت TTcDR مستقرة أيضًا لأكثر من خمسة أجيال من التخفيف المتسلسل عندما تم نقل 4٪ فقط من منتج تفاعل PURErep / pREP النهائي مباشرة إلى خليط PURErep الجديد ( 1f) الاستنتاج الرئيسي لهذه الملاحظة هو أن منتجات TTcDR يمكن أن تكون بمثابة قوالب للتكرار الذاتي للحمض النووي على مدى عدة أجيال.

يلاحظ العلماء أن كمية كبيرة من المنتجات ذات الحركة الكهربي المنخفضة نموذجية للتكرار كحلقة متدحرجة ، والتي لوحظت أثناء التجارب. يمكن تمثيل منتجات التفاعل هذه عن طريق متناظرات عالية الوزن الجزيئي * و / أو مجموعات DNA / MgPPi.
Concatemer * - نسخ متعددة من تسلسلات DNA مجمعة في مجموعة متسلسلة.
كما تم الكشف عن تشكيل منتجات بحجم ~ 5 كيلو بايت. في عينات غير معالجة. ويترتب على ذلك أن تفاعلات TTcDR يمكن أن تنتج كميات كبيرة من نسخ أحادية pREP.

بالإضافة إلى ذلك ، تمكن العلماء من تحويل منتجات الإشريكية القولونية بعد إزالة البلازما الأم. كانت منتجات التفاعل المنقى الناتجة متطابقة في الحجم مع pREPs أحادية.

في المرحلة التالية ، قرر العلماء إنشاء مجموعة من الجينات المشفرة للمكونات المهمة لتفاعل PURE: 31 ، عامل ترجمة أساسي (FT) لبكتيريا E. coli .

لهذا ، تمت دراسة TTcDR من pREP (4.6 كيلوبايت) بالاشتراك مع كل من البلازميدات الثلاثة الكبيرة *: pLD1 (30 bp، 13 FT) و pLD2 (20 bp، 8 FT) و pLD3 (23 bp، 9 FT). تم استنساخهم جميعًا لتوفير التعبير المؤتلف عن 30 من 31 من عوامل الترجمة للبكتيريا E. coli .
البلازميدات * هي جزيئات DNA صغيرة قادرة على التكاثر المستقل.
أظهرت منتجات TTcDR لجميع البلازميدات الأربعة (بما في ذلك pREP) ميزات تقييد MluI متطابقة: Plasmal clonal ، التي يتم نشرها عادةً في E. coli ( 2a ).


الصورة رقم 2

ومن الجدير بالذكر أيضًا أنه يمكن تحويل منتجات pLD TTcDR مباشرة إلى E. coli ، حيث يتم تخزينها على شكل بلازميدات أحادية.

يوفر خليط PURErep المعدل أيضًا تكرارًا كاملاً لجميع بلازميدات pLD الثلاثة مع PURErep أثناء التفاعل في وسط مشترك ( 2 ب ).

لم يتوقف العلماء عند هذا الحد ، وحاولوا بالفعل في المرحلة التالية من الدراسة توسيع الحمل الجيني لنظام TTcDR عن طريق النسخ المتماثل للبلازميدات التي ترميز مكونات إضافية لنظام PURE: EF-Tu (pEFTu) ، وهو غائب في نظام pLD ، وكذلك ribosomal RNA operon * rrnB ( الحمض الريبي النووي النقال هو الحمض الريبي النووي الريبي السلائف) الذي يشفر 23S rRNA (ribosomal RNA) ، 16S rRNA ، 6S rRNA و tRNA (نقل RNA ، في هذه الحالة Glu2) ( 2c ).
Operon * هي وحدة وظيفية للجينوم أحادي الخلية ، والتي تتضمن جينات ترميز البروتينات.
أكدت تجارب QPCR التي تستهدف أمبليكونات محددة من البلازميد * أن الوحدات الأحادية لجميع البلازميدات الستة (كان إجمالي طول الحمض النووي 93 كيلوبايت) تتكرر حوالي 2-8 مرات مقارنةً بالرقم الأصلي ( 2 ج ).
Amplicon * عبارة عن وحدة تضخيم خارج الصبغي ( نسخ أقسام الحمض النووي).
كان التأكيد الإضافي على نجاح تكاثر البلازميد المشترك هو تكوين مستعمرات مقاومة إما للزيوسين (pREP) ، أو للكانامايسين (البلازميدات pLD و prRNA) ، أو الكاربينيسلين (pEFTu). كانت هذه المستعمرات نتيجة تحويل منتجات تفاعل PURErep المعالجة بـ DpnI ( 2d ).

أكدت 26 مستعمرة مستنسخة مختارة يتبعها تحليل التقييد مرة أخرى نجاح TTcDR لجميع البلازميدات الستة ( 2e ).

باستخدام نفس الطريقة الموضحة سابقًا ، قام العلماء بإجراء آخر لتكرار المفاصل لخمسة بلازميدات إضافية: جينات نظام التجدد الأدنى لنوكليوزيد ثلاثي الفوسفات على أساس الكرياتين كيناز (pCKM) ، أدينيلات كيناز (pAK1) ونيوكليوزيد ثنائي فوسفات كيناز (pNDK) ؛ بالإضافة إلى T7 RNA polymerase (T7RNAP) و pyrophosphatase (pIPP).


الصورة رقم 3

بإجمالي حجم 116.3 كيلو بايت تصل هذه المجموعة المكونة من 11 بلازميدًا إلى> 100٪ من طول الجينوم المقدر المقترح لنظام الحد الأدنى من التكاثر الذاتي الذي يعتمد فقط على العناصر الغذائية منخفضة الوزن الجزيئي ( 3 أ ).

ثم قرر العلماء التحقق مما إذا كان PURErep يمكن أن يوفر تعبيرًا جينيًا موازيًا أثناء التكرار. لهذا ، تم فحص التعبير متعدد المستويات لـ FT المشفر على ثلاثة بلازميدات pLD: pLD1 و pLD2 و plD3 (لا يشمل pEFTu).

من أجل استقصاء ما إذا كان PURErep قادرًا على دعم التعبير متعدد الأوجه من هذه البلازميدات بشكل عام ، تم إجراء تعبير خالٍ من الخلايا من كل بلازميد فردي في وجود BODIPY-Lys-tRNALys ، والذي يوفر وسم مضان لمنتجات الترجمة.

من أجل تحسين حساسية الكشف وتمكين القياس الكمي للبروتينات المركبة حديثًا ، تم إجراء تحليل كمي لتعبير البروتين بناءً على مطياف الكتلة باستخدام تسميات نظائرية مستقرة.


الصورة رقم 4

قدم هذا التحليل أدلة مقنعة لتوليف جميع الوحدات الفرعية FT من البروتينات المشفرة بواسطة pLD ( 4a ). ولوحظ أيضا تجديد جزئي أو كامل للبروتينات المشفرة في كل من pLD2 و pLD3.

أظهر تحليل التعبير أنه حتى في PURErep غير المعدلة بالاشتراك مع pREP ، هناك تكرار كامل لـ 32 FT Cidrons مشفرة بواسطة pLD ، والتعبير عن حوالي نصف سلاسل الببتيد FT المشفرة ، التي يتوافق عددها مع أو يتجاوز السلسلة الأولية.

لمعرفة أكثر تفصيلا مع الفروق الدقيقة في الدراسة، أوصي بأن تنظر في تقرير العلماء و مواد إضافية لذلك.

الخاتمة


في هذا العمل ، تمكن العلماء من تحقيق ما كان يحلم به العديد من زملائهم في السابق - إنشاء نظام اصطناعي قادر على التكرار الذاتي.

هذا قول مبالغ فيه يعني أنهم كانوا قادرين على اتخاذ الخطوات الأولى نحو إنشاء نظام يقوم بالتكاثر الذاتي ، وبالتالي محاكاة العمليات البيولوجية قدر الإمكان.

إن مؤلفي الدراسة سعداء للغاية بالنتائج ويخططون لتوسيع الجينوم الاصطناعي مع شرائح DNA إضافية في المستقبل. إنهم يريدون إنشاء نظام بقشرة يمكنها الحفاظ على قابليتها للحياة عن طريق امتصاص العناصر الغذائية والتخلص من النفايات. يمكن استخدام مثل هذا الهيكل الاصطناعي كجهاز حيوي متخصص لإنتاج المواد الطبيعية أو كأساس لإنشاء أنظمة أكثر تعقيدًا.

الاستنساخ هو عملية معقدة لا شك فيها ، ولكن إنشاء نظام اصطناعي كامل وقابل للحياة هو مستوى مختلف تمامًا. سيقول شخص ما أن مثل هذه الدراسات خطيرة ، لأنه لا يحق لأحد تحمل مسؤوليات الطبيعة الأم. ومع ذلك ، يكاد يكون من المستحيل تهدئة فضول الشخص. إن رغبتنا في فهم كل شيء وتكرار كل شيء هي أحد العوامل الدافعة في تقدم العلم. للأفضل أو للأسوأ ، هذا سؤال لا توجد له إجابة واحدة. لا يسعنا إلا أن نعجب بإنجازات العقول المشرقة ونتطلع بحذر إلى المستقبل ، بينما نأمل في المدينة الفاضلة.

شكرا لكم على اهتمامكم ، ابقوا فضوليين وأتمنى لكم عطلة نهاية أسبوع رائعة يا رفاق! :)

القليل من الدعاية :)


أشكركم على البقاء معنا. هل تحب مقالاتنا؟ هل تريد رؤية مواد أكثر إثارة للاهتمام؟ ادعمنا عن طريق تقديم طلب أو التوصية لأصدقائك VPS القائم على السحابة للمطورين من $ 4.99 ، وهو نظير فريد من نوعه لخوادم مستوى الدخول التي اخترعناها لك: الحقيقة الكاملة عن VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 نوى) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps من $ 19 أو كيفية تقسيم الخادم؟ (تتوفر الخيارات مع RAID1 و RAID10 ، حتى 24 مركزًا و 40 جيجابايت DDR4).

Dell R730xd أرخص مرتين في مركز بيانات Equinix Tier IV في أمستردام؟ فقط لدينا 2 x Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 TV من 199 دولارًا في هولندا!Dell R420 - 2x E5-2430 2.2 جيجا هرتز 6C 128 جيجا بايت DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB - من 99 دولار! اقرأ عن كيفية بناء مبنى البنية التحتية الفئة c باستخدام خوادم Dell R730xd E5-2650 v4 بتكلفة 9000 يورو مقابل سنت واحد؟

More articles:


All Articles